Снижение экспрессии генов PPARG, ADIPOQ и SLC2A4 в подкожной жировой ткани у бариатрических пациентов с морбидным ожирением и сахарным диабетом 2 типа

ОБОСНОВАНИЕ

Масштаб распространенности ожирения остается важной медико-социальной проблемой во всем мире [1]. Ожирение ассоциировано с развитием сопутствующих патологий, а именно инсулинорезистентности (ИР), сахарного диабета 2 типа (СД2), метаболического синдрома (МС), сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Жировая ткань (ЖТ) является активным эндокринным органом и источником биологически активных молекул — адипокинов, которые участвуют в центральной и периферической регуляции энергетического обмена, метаболизма липидов и глюкозы, а также в регуляции воспаления. При ожирении баланс секреции адипокинов нарушается, что проявляется в изменении концентрации основных адипокинов в сыворотке крови. Так, концентрация адипонектина, который участвует в регуляции энергетического обмена, в метаболизме жирных кислот и глюкозы, обладает противовоспалительными и антиатерогенными свойствами, в сыворотке крови снижается при ожирении [2][3]. Концентрация лептина, который играет важную роль в регулировании аппетита [4], напротив, увеличивается, и по мере прогрессирования ожирения развивается лептинорезистентность [5][6]. Данный дисбаланс является следствием нарушения функции жировой ткани на фоне нарушения пищевого поведения и других причин, на молекулярно-генетическом уровне проявляющийся в изменении экспрессии генов адипонектина (ADIPOQ), лептина (LEP) и других ключевых белков, участвующих в регуляции метаболизма липидов и глюкозы [7][8].

Ядерный рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом, гамма (PPARγ), является ключевым фактором транскрипции, контролирующим экспрессию генов адипокинов в жировой ткани [9]. PPARγ принимает участие в регуляции адипогенеза, в транскрипционном контроле метаболизма липопротеинов и чувствительности к инсулину, регулирует активность генов, участвующих в высвобождении, транспорте и хранении жирных кислот [10]. В частности, PPARγ стимулирует экспрессию гена SLC2A4, кодирующего инсулин-зависимый транспортер глюкозы GLUT4, в адипоцитах [9], и поэтому указанный фактор транскрипции является основной мишенью для противодиабетических препаратов, таких как тиазолидиндионы [11]. Таким образом, изменение активности PPARγ может являться фактором патогенеза инсулинорезистентности при ожирении.

Бариатрическое вмешательство в настоящее время является эффективным методом лечения морбидного ожирения и ассоциированного с ним СД2, позволяет добиться более значительного (до 90%) и стойкого снижения избыточной массы тела, формирования новых пищевых привычек, длительной компенсации ассоциированных заболеваний [12]. С другой стороны, показания к проведению бариатрических операций предполагают неэффективность консервативных методов лечения ожирения, а при морбидном ожирении вероятнее всего развитие выраженной дисфункции ЖТ. Можно предположить, что при манифестации СД2 изменения экспрессии генов PPARG, ADIPOQ, LEP и SLC2A4 в данной когорте пациентов могут быть более выражены. Кроме того, поскольку подкожная (ПЖТ) и висцеральная (ВЖТ) жировая ткань различаются по метаболической активности и провоспалительному статусу [13], и могут быть по-разному вовлечены в патогенез сопутствующих заболеваний при ожирении, исследования должны проводиться с использованием обоих жировых депо.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данного исследования являлось изучение уровня экспрессии генов PPARG, ADIPOQ, LEP, SLC2A4 в подкожной и висцеральной жировой ткани (ПЖТ и ВЖТ) у бариатрических пациентов с морбидным ожирением и СД2, а также оценка корреляции концентрации адипонектина и лептина в сыворотке крови с экспрессией указанных генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Сбор парных образцов ПЖТ и ВЖТ у бариатрических пациентов и представителей контрольной группы (без ожирения) был проведен сотрудниками Центра хирургического лечения ожирения и метаболических нарушений ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург. При нахождении в стационаре в рамках обследования пациентам с ожирением выполнялись исследования концентрации глюкозы, липидов, инсулина, С-пептида, гликированного гемоглобина в сыворотке крови, рассчитывался индекс инсулинорезистентности. Молекулярно-генетические исследования были проведены в отделе молекулярно-генетических и нанобиологических технологий НИЦ ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург, в сотрудничестве с НИЦ «Курчатовский Институт» — ПИЯФ, Гатчина. Определение концентрации адипонектина и лептина выполнялось в ФГБНУ «ИЭМ», Санкт-Петербург.

Время исследования. Исследование было проведено в период с марта 2022 по декабрь 2024 года.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Популяция 1 «Пациенты с ожирением без СД2»

Критерии включения: ожирение II-IV степеней (ИМТ 35 кг/м² и более), неэффективность консервативного лечения ожирения, выполнение бариатрической операции.

Критерии исключения: СД2, вторичное ожирение вследствие первичной эндокринной патологии, онкологические заболевания, продолжительность ремиссии которых после лечения составляет менее 5 лет, сопутствующие заболевания тяжелого течения в стадии декомпенсации.

Популяция 2 «Пациенты с ожирением и СД2»

Критерии включения: ожирение II-IV степеней (ИМТ 35 кг/м² и более), СД2, неэффективность консервативного лечения ожирения, выполнение бариатрической операции.

Критерии исключения: вторичное ожирение вследствие первичной эндокринной патологии, онкологические заболевания, продолжительность ремиссии которых после лечения составляет менее 5 лет, сопутствующие заболевания тяжелого течения в стадии декомпенсации.

Популяция 3 «Пациенты без ожирения — контрольная группа»

Критерии включения: отсутствие ожирения (ИМТ менее 30 кг/м²), выполнение плановой операции на органах брюшной полости.

Критерии исключения: ожирение (ИМТ более 30 кг/м²), гипергликемия, СД2, сердечно-сосудистые заболевания, онкологические заболевания, продолжительность ремиссии которых после лечения составляет менее 5 лет, сопутствующие заболевания тяжелого течения в стадии декомпенсации.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

Выборка была сформирована сплошным способом.

Дизайн исследования

Исследование является одноцентровым, обсервационным исследованием типа «случай-контроль», одномоментным, двухвыборочным, сравнительным.

Методы

Оценка относительного уровня мРНК генов PPARG, ADIPOQ, LEP, SLC2A4

Биоптаты ПЖТ и ВЖТ во время проведения операций помещали в пробирки с раствором-стабилизатором РНК Intact RNA (Евроген, Россия) и хранили при температуре -80 ºС. Выделение тотальной РНК было выполнено с использованием реагента Qiazol (Qiagen, Германия) с последующем удалением примеси геномной ДНК при обработке ДНКазой (DNase I, RNase-free, Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции производителя. Для последующего синтеза кДНК был использован набор реагентов Revert Aid First cDNA Synthesis kit (Thermo Fisher Scientific, США). Отсутствие деградации РНК было проверено с помощью электрофореза в 1% агарозном геле по соотношению интенсивности полос, соответствующих 28S и 18S рРНК (2:1 в случае отсутствия деградации). Относительный уровень мРНК генов PPARG, ADIPOQ, LEP, SLC2A4 определяли с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе CFX96 (BioRad, США). Последовательности праймеров и зондов, использованных в работе, указаны в таблице 1. Для каждого образца измерение было выполнено минимум в трех повторах. На каждый ПЦР планшет в качестве отрицательного контроля наносили образец без кДНК, а также контрольный образец — пул кДНК жировой ткани, полученный от представителей контрольной группы (по три повтора). Количество мРНК гена интереса нормировали по отношению к мРНК референсных генов ACTB и RPLP0.

Оценка концентрации адипонектина и лептина в сыворотке крови

Концентрация адипокинов в сыворотке крови пациентов и лиц контрольной группы была определена методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов ELISA (для адипонектина BioVendor RD195023100 Human Adiponectin ELISA; для лептина DRG Diagnostics (Germany) EIA-2395 Leptin Sandwich ELISA) на спектрофотометре xMark (BioRad, США).

Статистический анализ

Статистический анализ выполнялся в среде R-Studio с использованием встроенных пакетов R версии 4.2.1. Соответствие данных нормальному распределению проверяли с использованием критерия Шапиро–Уилка. Для оценки различий между двумя группами использовали непараметрический U–критерий Манна–Уитни, между тремя группами с последующим попарным сравнением и с учетом поправки на множественные сравнения — тест Данна. Для анализа корреляции между количественными показателями пользовались методом Спирмена. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Этическая экспертиза

Работа была одобрена локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. академика И.П. Павлова (протокол № 259 от 28.02.22), все пациенты подписали информированное согласие.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование было проведено в группе 53 пациентов с ожирением II-IV степеней (ИМТ более 35 кг/м², средний возраст 44,1±11,2 года, 24,5% мужчин, 75,5% женщин; 26 пациентов с СД2, 27 — без СД2). Пятнадцать индивидуумов без ожирения (ИМТ — 25,2±3,2 кг/м², средний возраст 46,7±12,8 года, 26,7% мужчин, 73,3% женщин) составили контрольную группу. В таблице 2 представлены антропометрические и биохимические показатели указанных групп.

Как показано на рис. 1, морбидное ожирение ассоциировалось со снижением экспрессии генов PPARG, SLC2A4 и ADIPOQ в обоих типах жировых депо, причем в большей степени и со статистической достоверностью — при наличии сопутствующего СД2.

Так, уровень мРНК гена PPARG был снижен в ВЖТ и ПЖТ у пациентов с ожирением и СД2 по сравнению с контрольной группой (p=0,034 и р=0,008, соответственно) (рис. 1). Кроме того, экспрессия гена PPARG в ПЖТ обратно коррелировала с рядом биохимических показателей — с концентрациями глюкозы (r=-0,401, p=0,002), С-пептида (r=-0,354, p=0,040), триглицеридов (ТГ) (r=-0,497, p=0,001) в сыворотке крови и с индексом инсулинорезистентности (r=-0,354, p=0,037).

Аналогичным образом, уровень мРНК гена SLC2A4 в ПЖТ был снижен у пациентов с ожирением и СД2 по сравнению с контрольной группой (p=0,028) (рис. 1), и также прослеживалась отрицательная корреляция уровня мРНК гена SLC2A4 в ПЖТ с концентрацией глюкозы (r=-0,302, p=0,025) и ТГ (r=-0,392, p=0,010) в сыворотке крови.

Уровень экспрессии гена ADIPOQ был снижен у пациентов с ожирением и СД2 в обоих типах жировой ткани (p=0,026 и р=0,037 для ВЖТ и ПЖТ, соответственно), что согласовалось с уменьшением концентрации адипонектина в сыворотке крови у этих лиц (рис. 1). Уровень мРНК гена ADIPOQ в ПЖТ отрицательно коррелировал с окружностью талии (r=-0,435, p=0,006) и уровнем ТГ в сыворотке крови (r=-0,450, p=0,002). Уровень мРНК гена ADIPOQ в ВЖТ отрицательно коррелировал с концентрацией С-пептида (r=-0,401, p=0,019) в сыворотке крови и с индексом инсулинорезистентности (r=-0,403, p=0,016).

Концентрация лептина в сыворотке крови была повышена как у пациентов с ожирением без СД2 (р=0,000) (рис. 1), так и у пациентов с ожирением и СД2 (р=0,013) (рис. 1). Была выявлена положительная корреляция концентрации лептина в сыворотке с ИМТ (r=0,426, p=0,004). При этом уровень мРНК гена LEP как в ПЖТ, так и ВЖТ не отличался между исследуемыми группами (рис. 1).

Далее мы проанализировали взаимосвязь секреторной активности жировой ткани с уровнем экспрессии вышеперечисленных генов в обоих жировых депо. Уровень лептина в сыворотке крови положительно коррелировал с уровнем мРНК гена LEP в ПЖТ (r=0,477, p=0,005) (таблица 3). Такая же тенденция наблюдалась и для адипонектина сыворотки крови и уровня экспрессии в ПЖТ гена, кодирующего данный белок (r=0,323, p=0,062) (таблица 3). Концентрация адипонектина в сыворотке крови достоверно положительно коррелировала с уровнями мРНК генов PPARG и SLC2A4 в ПЖТ (таблица 3). Следует отметить, что нами выявлена однонаправленная положительная корреляция между уровнями мРНК генов PPARG, SLC2A4, ADIPOQ и LEP в обоих исследуемых жировых депо (таблицы 3 и 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Репрезентативность выборок

Выборка была малого объема (53 пациента с ожирением и 15 лиц без ожирения), поскольку исследование являлось одноцентровым и проводилось в течение ограниченного временного периода. В связи с этим существует риск нерепрезентативности выборки в отношении общей популяции.

Сопоставление с другими публикациями

В настоящем исследовании продемонстрировано выраженное одновременное снижение уровня экспрессии генов PPARG, SLC2A4 и ADIPOQ в подкожной жировой ткани у пациентов с морбидным ожирением и СД2. Полученные результаты согласуются с данными ряда зарубежных работ [14][15], а также исследований, проведенных нами ранее [16][17], где было показано снижение экспрессии генов PPARG, SLC2A4 и ADIPOQ в ЖТ при ожирении, в том числе в ПЖТ [18]. При этом снижение уровня экспрессии гена PPARG в ЖТ у пациентов с СД2 было более выражено, чем у пациентов с нарушениями метаболизма, предшествующими диабету [19]. Концентрация адипонектина в сыворотке крови у пациентов с ожирением и СД2 была ожидаемо ниже по сравнению с контрольной группой, а также по сравнению с пациентами с ожирением без СД2. Ранее было показано, что низкая концентрация адипонектина в сыворотке крови ассоциирована с риском метаболических осложнений [20]. Концентрация лептина в сыворотке крови была выше у пациентов с ожирением с/без СД2 по сравнению с контрольной группой, что также согласуется с данными, полученными ранее [21]. Несмотря на значимое повышение концентрации лептина в сыворотке крови у пациентов с ожирением, различий уровня экспрессии гена LEP в ПЖТ и ВЖТ между исследуемыми группами выявлено не было. Нужно отметить, что в литературе по данному вопросу представлены противоречивые данные, однако полученные нами результаты согласуются с несколькими работами [15][22]. При этом концентрация лептина в сыворотке положительно коррелирует с уровнем мРНК гена LEP в ПЖТ, такая же тенденция прослеживается и в случае корреляции концентрации адипонектина в плазме с уровнем мРНК гена ADIPOQ в ПЖТ, то есть можно предположить, что именно ПЖТ вносит основной вклад в пул этих адипокинов в сыворотке крови. В более ранней нашей работе мы показали, что положительная корреляция между уровнем мРНК гена ADIPOQ в ПЖТ и концентрацией адипонектина в сыворотке крови наблюдается у лиц без избыточного веса и ожирения (ИМТ менее 25), однако с увеличением массы тела, в том числе за счет доли висцерального жира, данная корреляция не всегда прослеживается, как в настоящей работе [3][16].

Снижение концентрации адипонектина в крови ранее было показано при ожирении и СД2 [3][16][23]. Адипонектин играет важную роль в регуляции чувствительности к инсулину: на мышиных моделях с инсулинорезистентностью было продемонстрировано снижение содержания адипонектина в сыворотке крови, при этом после введения данного адипокина полностью восстанавливалась инсулинчувствительность [24]. Следует отметить, что снижение концентрации адипонектина в сыворотке крови является независимым фактором риска ишемической болезни сердца, а также маркером эффективности терапии этого заболевания [25]. Нами ранее было показано снижение уровня мРНК гена ADIPOQ в ПЖТ при ишемической болезни сердца [26], что также свидетельствует о том, что адипонектин может играть центральную роль в патогенезе данного заболевания при ожирении, а снижение его экспрессии в ПЖТ может способствовать развитию ишемической болезни сердца у бариатрических пациентов.

По результатам настоящего исследования обращает на себя внимание своего рода скооперированность, то есть взаимная положительная корреляция, экспрессии генов PPARG, SLC2A4, ADIPOQ и LEP в жировой ткани. Поскольку SLC2A4 и ADIPOQ являются таргетными генами для транскрипционного фактора PPARγ, положительные корреляции уровней мРНК этих генов вполне можно ожидать. Лиганд-зависимая активация PPARγ повышает уровень экспрессии как адипонектина [27], так и GLUT4 [9]. С другой стороны, наблюдаемая положительная корреляция между уровнем мРНК гена PPARG и LEP в ПЖТ и ВЖТ не является очевидной, хотя о ней ранее сообщали и другие авторы [28][29]. Транскрипционная активность гена LEP снижается в присутствии лигандов, активирующих PPARγ [30]. И наоборот лептин через альтернативные механизмы может подавлять экспрессию PPARγ в ЖТ [30]. Однако, в регуляторной области гена LEP был обнаружен дополнительный сайт для PPARγ, который, как предполагается, может включаться в регуляцию экспрессии гена LEP в ответ на накопление жировой массы [31]. Также следует принимать во внимание эпигенетическую регуляцию гена лептина. Ранее показано увеличение степени метилирования промотора гена LEP при ожирении [32]. В некоторых исследованиях было продемонстрировано снижение экспрессии гена LEP при увеличении ИМТ, но в пределах до 35 кг/м², то есть при избыточном весе и ожирении I степени [33]. Сложные механизмы регуляции могут объяснять отсутствие изменений уровня мРНК в ЖТ на фоне повышения концентрации лептина в крови при ожирении.

Клиническая значимость результатов

Наличие СД2 у пациентов с морбидным ожирением ассоциируется со снижением синтеза в ПЖТ и секреции адипонектина, что может дополнительно повышать риск атеросклероза у таких пациентов.

Ограничения исследования

Небольшой размер выборки и проведение исследования только в одном центре не позволяет в полной мере судить о том, в какой мере полученные результаты воспроизведутся на других когортах. Кроме того, преобладание в исследовании представителей одного пола (женщин) также могло отразиться на его результатах. В связи с одномоментным характером исследования, нельзя сделать заключение о причинно-следственных связях.

Направления дальнейших исследований

Нужно отметить, что ранее было продемонстрировано одновременное гиперметилирование регуляторных областей генов PPARG, SLC2A4, ADIPOQ в адипоцитах при развитии инсулинорезистентности [34], что согласуется с полученными нами данными о снижении экспрессии этих генов в ПЖТ у пациентов с морбидным ожирением и СД2.

Ряд исследований продемонстрировал повышение уровня экспрессии генов PPARG, ADIPOQ и GLUT4 и снижение экспрессии гена LEP при снижении веса после бариатрических операций [35][36], хотя данные носят противоречивый характер, например в нескольких исследованиях экспрессия гена адипонектина после бариатрического вмешательства снижалась [2][22]. Следует отметить актуальность проведения проспективных исследований на данной когорте пациентов с оценкой степени метилирования регуляторных областей генов PPARG, SLC2A4 и ADIPOQ как при наборе веса, так и при его снижении после проведения бариатрических операций.

С другой стороны, одновременное повышение экспрессии PPARG, SLC2A4, ADIPOQ рассматривается в настоящее время как возможная терапевтическая стратегия лечения развития СД2 на фоне ожирения [37]. Поэтому поиск новых биологически активных малых молекул, нацеленных на стимулирование экспрессии генов PPARG, SLC2A4 и ADIPOQ в адипоцитах без хирургического вмешательства, является актуальной задачей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие СД2 на фоне ожирения при ИМТ более 35 кг/м² ассоциировано со снижением уровней экспрессии генов PPARG, ADIPOQ и SLC2A4 в подкожной жировой ткани, выраженным снижением концентрации адипонектина и увеличением концентрации лептина в плазме крови.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование выполнено за счет средств: Госзадание ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова на тему «Ожирение, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания: молекулярно-генетические предикторы неблагоприятного течения и оптимизация выбора персонифицированной терапии» (1022040900079-2, уникальный номер реестровой записи 720000Ф.99.1.БН62АБ13000); Госзадание ФГБНУ ИЭМ на тему «Молекулярно-клеточные механизмы участия макрофагов в регуляции функции эндотелия на разных этапах формирования атеросклеротических поражений» (шифр № FGWG-2025-0007); Госзадание Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема №1024011100004-4-1.6.8;1.6.4;1.6.7;1.6.1. «Функциональная и структурная организация сложных, мультикомпонентных биологических систем и их динамика. Молекулярные и клеточные компоненты патогенеза социально-значимых заболеваний»).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Мирошникова В.В. — разработка концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация результатов, написание статьи; Драчева К.В. — получение данных (экспериментальная часть), статистическая обработка данных, написание статьи; Грунина М.Н. — анализ и интерпретация результатов, написание текста статьи; Анисимова К.А. — получение данных (экспериментальная часть), внесение важных правок в рукопись; Изюмченко А.Д. — получение данных (экспериментальная часть), написание статьи; Берулава Е.Т. — получение данных (экспериментальная часть), внесение важных правок в рукопись; Баландов С.Г. — получение данных (экспериментальная часть), внесение важных правок в рукопись; Танянский Д.А. — анализ и интерпретация результатов, внесение важных правок в рукопись; Василевский Д.И. — получение данных (экспериментальная часть), анализ и интерпретация результатов, внесение важных правок в рукопись; Пчелина С.Н. — разработка концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация результатов, написание статьи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.