Развитие метаболического синдрома и функциональное состояние брыжеечных артерий у самок крыс, получавших высокожировую диету

ОБОСНОВАНИЕ

Эпидемиологические исследования, проведенные в последнее время, показали рост заболеваемости метаболическим синдромом (МС), одним из частых осложнений которого является сахарный диабет. Термином «МС» принято называть комплекс патогенетических факторов, таких как артериальная гипертензия, дислипидемия, инсулинрезистентность, ожирение, сердечно-сосудистые нарушения [1]. Причину развития МС связывают с изменением профиля питания, в частности с избыточным потреблением жиров и углеводов [2]. Oценка гендерной предрасположенности к МС показала, что у людей после 50 лет распространенность МС гораздо выше среди женщин, чем мужчин, и это связывают c изменением гормонального статуса после менопаузы [3].

Для поиска методов лечения или предупреждения негативных последствий изменений качества питания необходимо изучение механизмов развития МС. Клинические исследования показали, что у людей избыточное потребление жиров и углеводов приводит к общему и висцеральному ожирению, повышению уровня триглицеридов, холестерина, ЛПНП в крови, нарушению чувствительности к глюкозе и инсулинрезистентности, артериальной гипертензии, развитию сердечно-сосудистой патологии [4]. Сложность патофизиологических процессов и их взаимовлияние друг на друга обусловливают необходимость проведения экспериментальной оценки механизмов (физиологических, биохимических, эпигенетических) МС, которая позволит разработать методы коррекции состояния систем и органов при данном заболевании. Обычно для моделирования МС на животных используют различные варианты высококалорийных диет (высокожировых, высокоуглеводных или их сочетание) [5][6].

Наши предыдущие исследования показали, что избыточное потребление жиров самцами крыс приводит к нарушению углеводного и липидного обмена, висцеральному ожирению, эндотелиальной дисфункции [7]. Основное количество исследований проводится на самцах грызунов, тогда как развитие МС у самок имеет свои особенности. Это актуальный вопрос, поскольку на развитие ожирения значительное влияние оказывает гормональный статус, в частности, показано ухудшение показателей при МС у женщин в период менопаузы [8]. Защитное действие эстрогенов на липидный обмен продемонстрировано как у людей [9], так и у экспериментальных животных, например, у самок мышей [10]. При МС, вызванном высокоуглеводной диетой, наблюдается усиление нарушений липидного обмена и функционального состояния брыжеечных артерий и микрососудистого русла кожи у самок крыс после овариогистерэктомии по сравнению с интактными животными [11]. Моделирование на животных дает возможность получить не только биохимические и морфометрические характеристики, но и оценить функционального состояние сосудов различного типа, а также уточнить конкретные механизмы наблюдаемых при МС нарушений. Так, было показано, что у самцов крыс при потреблении избыточного количества жиров подавление дилататорной реакции артерий на действие ацетилхолина (АХ) опосредуется снижением эффективности NO-зависимых механизмов [7]. Снижение амплитуды АХ-индуцированной релаксации отмечено и в других исследованиях in vitro [12][13]. Поскольку именно сердечно-сосудистые осложнения, такие как инфаркт и инсульт, являются основными причинами смерти при МС, вопрос о изучении механизмов изменений функции сосудов при ассоциированных с МС состояниях является актуальным.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования было оценить изменение липидного, углеводного обмена и функциональное состояние брыжеечных артерий у интактных и овариоэктомированных самок крыс при избыточном количестве жиров в диете.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Исследование проведено в лаборатории физиологии сердечно-сосудистой и лимфатической систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург.

Время исследования. Исследование выполнялось с 15 марта 2024 по 15 июля 2024 г.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Эксперименты проведены на одной популяции, использованы самки крыс стока Wistar, возраст к началу исследования 3 мес.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

Произвольный.

Дизайн исследования

Проведено одновыборочное сравнительное исследование.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

В исследование включена одна популяция крыс стока Wistar, самки возрастом 3 месяца на начало эксперимента. Все животные были разделены на 4 группы — 2 контрольные и 2 диетные.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

Выборка формировалась произвольно.

Дизайн исследования

Исследование относится к интервенционному одновыборочному контролируемому исследованию. Рандомизацию животных по четырем группам проводили случайным образом. В первую высокожировую (HFD, high fat diet) группу вошли самки крыс, получавшие диету с избыточным содержанием животных жиров, во вторую высокожировую OvHFD группу вошли овариоэктомированные самки крыс, получавшие диету с избыточным содержанием животных жиров. Третья контрольная CG группа состояла из здоровых интактных самок крыс, четвертая OvCG группа — из самок крыс, подвергнутых овариоэктомии.

Описание медицинского вмешательства (для интервенционных исследований)

Животные высокожировых групп (HFD, OvHFD) получали диету, содержащую 50% животных жиров (по калорийности). Длительность диетического воздействия составляла 10 недель. Контрольные группы (CG и OvCG) содержались на стандартном пищевом рационе (15% животных жиров по калорийности). Кроме того, крысам OvCG и OvHFD групп за 4 недели до начала эксперимента была проведена овариоэктомия. Все животные получали корм и питьевую воду ad libitum, содержались в одинаковых условиях вивария по 5 крыс в клетке.

Овариоэктомию проводили под наркозом (Золетил 100, 20 мг/кг), яичники удалялись через два симметричных разреза после перевязки яйцевода нерассасывающейся лигатурой. Животные получали однократно Ветбицин-3 (ОАО Синтез, Россия) из расчета 10 000 ЕД/кг.

Эвтаназию осуществляли декапитацией, крысы оставались под наркозом после исследования реактивности брыжеечных артерий. Сбор крови для биохимического анализа проводили из шейных вен, после чего выделяли и взвешивали органы и ткани.

Методы

Измерение уровня АД проводили манжеточным методом на хвосте на установке для определения АД у грызунов «Систола», Россия.

В конце срока наблюдения проводили инсулинрезистентный тест (ИРТ), при этом крысам, предварительно голодавшим 6 ч, вводили интраперитонеально инсулин из расчета 0,75 ЕД/кг (Инсуман Рапид ГТ, Sanofi Aventis, Germany) и оценивали динамику уровня глюкозы в крови в течение 120 минут. Также проводили глюкозотолерантный тест (ГТТ), для чего животным после 12 ч голодания вводили интраперитонеально раствор глюкозы из расчета 2 г/кг, и оценивали динамику уровня глюкозы в крови в течение 120 минут.

Исследование реактивности брыжеечных артерий in vivo проводили у наркотизированных тилетамин/золазепамом (20 мг/кг, Zoletil 100, Vibrac, Франция) крыс согласно описанной ранее методике [7]. Для оценки эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации использовали ацетилхолин (АХ, Sigma-Aldrich, США) 1×10⁻⁵ моль/л и нитропруссид натрия (НП, ICN Biomedicals, США) 1×10⁻⁶ моль/л на фоне предварительного сокращения сосуда фенилэфрином (ФЭ, Sigma-Aldrich, США) 1×10⁻⁵ моль/л. Амплитуду дилатации выражали в процентах от амплитуды констрикции, вызванной ФЭ. Для уточнения влияния различных концентраций АХ на дилатацию брыжеечных артерий проводили оценку амплитуды релаксации при постепенном ступенчатом повышении концентрации АХ (1×10⁻¹⁰–1×10⁻⁵ моль/л), оценивали кумулятивный эффект. С целью оценки участия NO-зависимого механизма в АХ-индуцированной вазодилатации использовали блокатор NO-синтазы L-NAME (N_ω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, ICN Biomedicals) 1×10⁻⁴ моль/л. Для оценки реакции сосудов проводили фото и видео регистрацию диаметра брыжеечных артерий крыс in vivo с использованием с микроскопа Биомед МС-1Т-ZOOM (Россия) и камеры Basler BASLER acA4600-10uc (Germany), результаты обрабатывались программой MultiMedia Catаlog (MMC).

Проводили расчет индекса массы миокарда (ИММ) и индекс массы висцерального жира (ИМВЖ), который равен массе органа/массу крысы (мг/г). Содержание триглицеридов, липопротеидов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП), общего холестерина в сыворотке крови определяли на анализаторе ARCHITECT c8000 (США) энзиматическим колориметрическим методом, используя наборы фирмы Abbott (США).

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica v.12. Полученные данные представляли в виде среднего с его стандартной ошибкой (М±SЕ). Для сравнения показателей с нормальным распределением в исследуемых выборках использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с попарными post-hoc сравнениями по критерию Тьюки. В случае распределения вариант в выборке, отличном от нормального, применяли критерий Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Этическая экспертиза

Все манипуляции с животными проводились в соответствии с принципами Базельской декларации при одобрении Комиссии по этике Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (протокол №03/13 от 13 марта 2023 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование были включены 4 группы самок крыс стока Wistar: контрольные (CG), n=12; контрольные овариоэктомированные (OvCG), n=12; крысы, получавшие высокожировую диету (HFD), n=14; овариоэктомированные крысы, получавшие высокожировую диету (OvHFD), n=14. При исследовании брыжеечных артерий были оценены реакции: у CG — 27 артерий, у OvCG — 30 артерий, у HFD — 20 артерий, у OvHFD — 19 артерий.

Проведенные исследования показали, что через 10 недель наблюдения исследованные группы крыс не различались по массе тела (табл. 1). ИМВЖ у OvCG не отличался от CG, у HFD — был на 26,2% больше, чем у CG, у OvHFD — на 58,1% больше, чем у OvCG, и на 19,4% больше, чем у HFD. ИММ не имел межгрупповых различий. Уровень АД у крыс OvCG был на 12,6% больше, чем у CG, у HFD — на 26,2% больше, чем у CG, и не отличался значимо от OvHFD.

Биохимические показатели крови крыс представлены в таблице 2. Уровень глюкозы в крови (натощак) у HFD группы был на 12,3% больше, чем у CG, у OvHFD — на 9,4% больше, чем у OvCG. У животных HFD и OvHFD групп содержание триглицеридов, холестерина, ЛПНП было значительно выше, чем в соответствующих контрольных группах, уровень ЛПВП у крыс HFD и OvHFD не достигал значимых отличий от соответствующего контроля.

Согласно результатам ИРТ, у крыс HFD и OvHFD групп отмечалось снижение реакции на введение инсулина по сравнению с соответствующими контрольными группами (рис. 1а). ГТТ показал повышенную реактивность на введение глюкозы у HFD и OvHFD групп по сравнению с животными CG и OvCG групп соответственно (рис. 1b). Кроме того, у самок OvCG группы при ГТТ максимальный подъем уровня глюкозы в крови был на 20,0% больше, чем у CG (р<0,001).

Исследование брыжеечных артерий in vivo при ступенчатом повышении концентрации АХ показало, что у HFD крыс амплитуда АХ-индуцированной релаксации была меньше, чем у CG, начиная с концентрации АХ 1х10⁻⁶ моль/л, у самок OvHFD по сравнению с OvCG — начиная с концентрации 1х10⁻⁷ моль/л (рис. 2а). Общая реактивность на АХ, оцениваемая по площади под кривой для АХ, у HFD была в среднем на 15,6% меньше, чем у CG, а у OvHFD — на 22,9% меньше, чем у OvCG (рис. 2b).

Оценка дилатации брыжеечных артерий при концентрации АХ 10⁻⁵ моль/л показала, что у самок HFD амплитуда релаксации была на 19,9% меньше, чем у CG, у OvHFD — на 21,3% меньше, чем у OvCG (табл. 3). По сравнению с величиной дилатации на АХ без блокаторов, предварительная инкубации сосудов c L-NAME привела к снижению амплитуды АХ-индуцированной релаксации сосудов у CG — на 68,0±3,6%, у OvCG — на 70,1±3,4%, у HFD — на 48,4±2,9%, у OvHFD — на 55,1±3,9%. Вызванная НП вазодилатация была снижена у крыс HFD на 32,3%, у OvHFD — на 32,2% по сравнению с CG и OvCG соответственно.

Нежелательные явления

При проведении исследования нежелательные явления не отмечены.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные эксперименты показали, что овариоэктомированные и интактные крысы, получавшие стандартный рацион, несколько отличались по исследованным показателям. Известно, что после двусторонней овариоэктомии или в менопаузе, когда прекращается продукция половых гормонов, оказывающих защитное действие на сердце и сосуды, заболеваемость МС значительно возрастает [14]. В наших экспериментах овариоэктомия у крыс при потреблении стандартной диеты не влияла ни на массу тела, и ни на массу висцерального жира, но вызывала рост АД. Потребление избыточного количества жиров самками крыс приводило к развитию симптомов, характерных для МС. Несмотря на отсутствие общего ожирения, у HFD и OvHFD крыс наблюдалось висцеральное ожирение, более выраженное у овариоэктомированных животных. Анализ биохимических параметров крови не выявил существенного различия в группах между получавшими высокожировую диету овариоэктомированными и интактными крысами, но показатели значительно отличались по сравнению с соответствующим контролем. В HFD и OvHFD группах диета с избыточным потреблением жиров стимулировала образование триглицеридов, ЛПНП, способствовала повышению уровня глюкозы крови, что является показателем развития МС. Интересные результаты показали проведенные ГТТ и ИРТ у контрольных животных, в частности, у OvCG, в сравнении с CG, толерантность к глюкозе оказалась сниженной, а инсулинрезистентность более выраженной при отсутствие различий в уровне гликемии натощак. Считается, что эстрогены, в частности, способствуют сохранению чувствительности тканей к инсулину [15], чем можно объяснить различия показателей углеводного обмена между овариоэктомированными и интактными животными.

Потребление избытка жиров приводило к изменению реакции на введение глюкозы, однако максимальный уровень глюкозы крови при ГТТ повышался в большей степени у крыс с сохраненными яичниками, чем у овариоэктомированных. У получавших высокожировую диету крыс при ИРТ наименьшую реакцию на введение инсулина показали овариоэктомированные животные, что говорит о большей степени инсулинрезистентности у данной группы, несмотря на то, что исходный уровень глюкозы крови у крыс данных групп не различался. Это ожидаемый результат, так как после овариоэктомии прекращается синтез эндогенных эстрадиола и прогестерона, которые, в частности, способствуют сохранению углеводного обмена [10], а при избытке жиров в диете стерилизованных крыс этот протективный механизм не реализуется. Таким образом, у овариоэктомированных животных избыточное потребление жиров приводит к более выраженной степени МС, чем у интактных животных.

У контрольных OvCG и CG крыс отсутствовали различия в степени висцерального ожирения, а высокожировая диета у OvHFD группы вызывала более выраженное висцеральное ожирение, чем у HFD.

Неожиданными оказались результаты оценки реактивности брыжеечных артерий при действии АХ. Несмотря на различия в уровне АД, реактивность брыжеечных артерий на АХ оказалась сходной у контрольных CG и OvCG групп. Это свидетельствует о том, что в условиях наших экспериментов через 14 недель после овариоэктомии и при содержании животных на стандартном рационе сохраняется эндотелийзависимая вазодилатация на уровне интактных животных. Однако реакция на НП имела некоторую тенденцию, хотя и статистически незначимую, к снижению у крыс после овариоэктомии, что говорит о возможном ухудшении чувствительности ГМК к NO. Также не отмечено значимых различий между OvHFD и HFD самками ни при ступенчатом повышении концентрации АХ, ни при максимальной концентрации АХ. Но реактивность артерий на АХ как HFD, так и OvHFD групп была значимо меньше, чем у соответствующего контроля. Это свидетельствует о том, что избыточное потребление жиров вызывает развитие эндотелиальной дисфункции, проявляющейся в подавлении вазодилататорного ответа. Поскольку АХ-индуцированная вазодилатация во многом опосредована NO-зависимым механизмом [16], мы оценили эффективность данного пути релаксации, сравнив амплитуду релаксации на АХ до и после предварительной инкубации сосудов с блокатором NO-синтазы L-NAME. У контрольных животных CG и OvCG снижение амплитуды дилатации после ингибирования синтеза NO было сходным. Это свидетельствует о том, что овариоэктомия у получающих стандартный рацион крыс не изменяла биодоступность NO, сохраняя эффективность NO-зависимых механизмов вазодилатации. Высокожировая диета приводила к нарушению продукции NO эндотелием, поскольку амплитуда индуцированного АХ ответа после действия L-NAME была ниже, чем без блокатора, при этом величина снижения была сходной у интактных и овариоэктомированных крыс. Биодоступность NO при вазодилатации зависит как от продукции NO эндотелием, так и от чувствительности гладкомышечных клеток (ГМК) к NO. Для оценки способности ГМК реагировать на NO мы сравнили величину дилатации при действии НП, экзогенного источника NO. У получавших стандартный рацион овариоэктомированных самок величина вызванной НП дилатации значимо не отличалась от интактных. Это означает, что овариоэктомия сама по себе не оказывала существенного влияния на работу сигнальной цепочки NO — растворимая гуанилатциклаза — цГМФ — протеинкиназа G, запускающей процесс расслабления ГМК. Потребление высокожирового рациона приводило к снижению реакции на НП в равной степени у HFD и OvHFD животных. Следовательно, развитие МС у самок снижает чувствительность ГМК к NO, нарушая процессы расслабления ГМК. Таким образом, независимо от эндокринного статуса, высокожировая диетическая нагрузка приводит к развитию эндотелиальной дисфункции, при этом подавление АХ-индуцированной вазодилатации происходит как за счет нарушения синтеза NO эндотелием, так и вследствие снижения чувствительности ГМК к NO.

Причину снижения реактивности сосудов на вазодилататорные агонисты связывают с системным воспалением, при котором повышается уровень С-реактивного белка в сыворотке крови и провоспалительных цитокинов — интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухоли (TNF-α) [17]. Все это приводит к повреждению эндотелиоцитов, изменению проницаемости и отеку тканей [18], что усугубляет эндотелиальную дисфункцию. Kim B. и соавторы (2023) показали еще один возможный механизм снижения реактивности сосудов при избыточном потреблении жиров, который связан с локальными изменениями липидного гомеостаза в сосудах, в частности, с накоплением богатых триглицеридами липидных капель в эндотелии, приводящим к снижению продукции NO за счет подавления стабильности мРНК eNOS и активации пути NF-κB κB / моноцитарный белок-хемоаттрактант-1 / eNOS, а также с развитием местного воспаления [19].

Отсутствие различий между овариоэктомированными и интактными самками в показателях липидного обмена и реактивности сосудов в наших исследованиях может быть следствием недостаточной длительности высокожировой диеты, поэтому необходимы исследования на данной модели при более длительном применении диетического воздействия, или при сочетании высокожировой и высокоуглеводной диет.

Сопоставление с другими публикациями

Представленные в данной статье результаты анализа биохимических показателей, подтвердившие развитие основных симптомов МС у крыс при потреблении высокожирового рациона, таких как дислипидемия (рост уровня триглицеридов, ЛПНП), соответствуют данным литературы [20]. В наших экспериментах показано, что высокожировая диета приводит к развитию инсулинорезистентности, что согласуется с результатами других исследований, которые выявили, что при избытке жиров в рационе ухудшалась переносимость глюкозы и чувствительность к инсулину у животных [21].

В нашем исследовании мы не обнаружили значимого влияния овариоэктомии на реактивность брыжеечных артерий у крыс, получавших стандартный рацион, хотя некоторыми авторами отмечено снижение эндотелийзависимой дилатации сосудов у животных после овариоэктомии, например, у крыс линии SD [22]. Отсутствие снижения реактивности сосудов у самок Wistar по сравнению с SD после овариоэктомии может быть следствием межлинейных различий.

Наши результаты показали, что высокожировая диета у крыс приводит к развитию эндотелиальной дисфункции, выражающейся в снижении реакции сосудов на дилататорные стимулы, опосредованной, в частности, нарушением NO-зависимых механизмов вазодилатации. Эти результаты согласуются как нашими предыдущими данными, полученными на самцах, содержащихся на высокожировом рационе [7], а также в целом соответствуют результатам других исследователей, оценивающих реактивность сосудов в режиме in vitro [12][13]. Наши исследования показали негативное влияние высокожирового рациона на реактивность брыжеечных артерий у самок крыс в экспериментах in vivo, при сохранении кровотока по исследованным сосудам.

Клиническая значимость результатов

Представленные результаты позволили сравнить влияние избыточного потребления жиров у овариоэктомированных и интактных самок крыс. После овариоэктомии развиваются изменения гормонального статуса, сходного с менопаузой, при этом некоторые симптомы МС оказываются более выраженными. Экспериментальное моделирование помогает выявить особенности течения МС не только у интактных, но и у стерильных самок, что позволяет составить более точное представление о механизмах наблюдаемых нарушений как при сохранении гормонального статуса, так и при прекращении синтеза женских половых гормонов. Это имеет особое значение для выработки способов предупреждения или лечения МС у женщин в менопаузе.

Ограничения исследования

Условия наших экспериментов не позволяют оценить существующие индивидуальные различия в количестве потребляемого крысами корма и воды, пищевого поведения, вследствие чего возможен разброс полученных показателей. Исследование проведено на одной линии животных, поэтому нельзя исключать, что полученные результаты в некоторой степени специфичны для линии Wistar. Нельзя исключать и некоторые неточности в интерпретации полученных данных на основе наших теоретических и практических знаний и допущений.

Направления дальнейших исследований

Планируется проведение исследований влияния высокожировой и/или высокоуглеводной диетических нагрузок на состояние липидного, углеводного обмена и функционального состояния сосудов крыс с генетически детерминированной артериальной гипертензией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Избыточное потребление жиров самками крыс сопровождается висцеральным ожирением, подъемом АД, дислипидемией, нарушением углеводного обмена. Развитие МС сопровождается эндотелиальной дисфункцией, проявляющейся снижением АХ-индуцированной дилатации вследствие как угнетения продукции NO эндотелием, так и снижения чувствительности ГМК к NO. У самок при высокожировой диетической нагрузке овариоэктомия усиливает висцеральное ожирение и инсулинрезистентность, но вызванные диетой изменения реактивности сосудов сходны с интактными животными,

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Pабота поддержана средствами федерального бюджета в рамках государственного задания ФГБУН Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН (№ 1021062411787-0-3.1.8).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Иванова Г.Т. — идея работы, планирование и проведение эксперимента, получение и обработка данных, написание и редактирование манускрипта.

Автор одобрил финальную версию статьи перед публикацией, выразил согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.