Иммуномодулирующее влияние капсаициноидов при метавоспалении у крыс линии Wistar с алиментарным ожирением

ОБОСНОВАНИЕ

Ожирение и избыточная масса тела занимают одно из ведущих мест в мире и являются серьезной проблемой здравоохранения. Результаты исследований механизмов нарушения метаболизма при ожирении убедительно показывают, что иммунная система принимает активное участие в регуляции обмена веществ [1]. С одной стороны, это сохранение целостности органов и тканей, контролирующих метаболизм, с другой — влияние метаболического статуса организма на эффекторные способности самих иммунных клеток [2]. Взаимосвязь метаболизма и иммунитета на системном и клеточном уровнях в настоящее время активно изучается и определяется как иммунометаболизм [3]. Воспалительный процесс в жировой ткани опосредован как дисфункциональными адипоцитами, которые секретируют провоспалительные адипокины, так и иммунными клетками, экспрессирующими цитокины и хемокины [4]. Установлено, что при ожирении, помимо жировой ткани, активированные иммунные клетки инфильтрируют скелетные мышцы, головной мозг, кишечник, поджелудочную железу [5]. Наличие хронического вялотекущего системного воспаления при ожирении доказывают обнаруженные корреляционные взаимосвязи между субпопуляциями лимфоцитов, метаболическими нарушениями и клиническими проявлениями [6]. Помимо лимфоцитов, существенную роль в поддержании воспалительного процесса (метавоспаления) играет активация макрофагов, дендритных клеток, NK-клеток (естественные киллеры) и других клеток, экспрессирующих медиаторы воспаления [7]. Установлено, что цитокины вносят существенный вклад в развитие нарушений метаболизма глюкозы и липидов. Задействованные механизмы до конца не изучены, но имеются данные, подтверждающие взаимосвязь цитокинового профиля с накоплением липидов в органах и тканях, включая жировую ткань и печень, изменениями в энергетическом обмене и экспрессией провоспалительных сигналов, поступающих от различных типов клеток, включая иммунные. Изменения уровней циркулирующих цитокинов могут служить биомаркерами для раннего выявления метаболических нарушений [8].

В настоящее время особую актуальность приобретают разработка и внедрение новых методов в терапии ожирения, которые должны быть эффективными, безопасными и широко доступными. Применение биологически активных веществ, полученных из растительного сырья, позволяет сформировать комплексный подход в терапии данной патологии [9, 10]. Капсаициноиды, в том числе капсаицин, являются биологически активными веществами, содержащимися в различных видах стручкового перца Capsicum. Капсаицин активно применяется в терапии ожирения, сердечно-сосудистой патологии, онкологических заболеваний в качестве обезболивающего, противовоспалительного, антиоксидантного, антиканцерогенного средства [11–13]. К основным механизмам, лежащим в основе положительного влияния капсаицина в терапии ожирения, относят повышение чувства насыщения и снижение аппетита, регулируемые гипоталамусом, положительное влияние на функцию желудочно-кишечного тракта и кишечный микробиом, усиление термогенеза и активация процессов окисления липидов [14–17]. Подтверждением этого может служить экспериментальное исследование на мышах C57BL/6J, получавших высокожировой рацион [18]. Пероральное введение гранул капсаицина, оказало статистически значимое влияние на биомаркеры ожирения за счет увеличения содержания адипонектина и снижения уровней лептина, свободных жирных кислот и инсулина в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой мышей, потреблявших стандартный рацион. В исследованных группах не было отмечено изменений массы печени, при этом наблюдалось значительное снижение количества белой жировой ткани у мышей основной группы. Несмотря на большое количество исследований, опубликованных в оригинальных статьях и обзорах, посвященных механизмам протективного влияния капсаициноидов на метаболические процессы при ожирении, вопрос иммуномодулирующего влияния данных биологически активных веществ остается открытым.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить влияния капсаициноидов на иммунный статус на модели алиментарного ожирения у крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Виварий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии».

Время исследования. Эксперимент проведен с 27 сентября по 21 ноября 2023 г.

Изучаемые популяции — изучалась одна популяция.

Критерии включения: для участия в эксперименте были выбраны крысы-самцы линии Wistar с исходной массой тела 350±10 г.

Критерии исключения: не применялись.

Способ формирования выборки — произвольный.

Дизайн исследования

Данное исследование было одноцентровое, экспериментальное, одномоментное, одновыборочное сравнительное, контролируемое, рандомизированное.

Эксперимент проводили в течение 8 недель на 3-х группах крыс самцов линии Wistar (по 10 животных, исходная масса тела 350±10 г), полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА». Животных содержали по 2 особи в пластиковых клетках на подстилке из древесных стружек при искусственном освещении с равной продолжительностью ночного и дневного периодов. Крысы получали полусинтетический стандартный рацион (группа 1) и высококалорийный холинодефицитный рацион (ВКХДР) (группы 2 и 3, ad libitum) [19]. Животным внутрижелудочно (3,33 мл/кг массы тела) вводили 3 раза в неделю подсолнечное масло (группы 1 и 2) и экстракт острого стручкового перца (капсаицин — 59%, дигидрокапсаицин — 31%, нордигидрокапсаицин — 4%; Hunan Insen Biotech Co., Ltd., КНР) в подсолнечном масле (группа 3) в разовой дозе 15 мг капсаициноидов/кг массы тела. Данная дозировка в пересчете [20] приближается к верхнему уровню возможного поступления капсаициноидов с рационом человека [21] и находится в диапазоне доз, используемых в экспериментах на животных и клинических исследованиях на добровольцах [22][23].

Гематологические исследования выполняли на гематологическом анализаторе Coulter ACT TM 5 diff OV (Beckman Coulter, США) с использованием реактивов производства этой же фирмы. Экспрессию рецепторов CD45R, CD3, CD4, CD8а, CD161 на лимфоцитах периферической крови крыс определяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, коньюгированных с флуоресцентными красителями: APC, FITC, РЕ («Miltenyi Biotec GmbH», Германия). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, США). Содержание CD45R+ клеток (B-лимфоциты), CD3+ (Т-лимфоциты) и CD161+ (NK-клетки) выражали в % от общего числа проанализированных клеток; содержание CD3+CD4+ (Т-хелперов) и CD3+CD8+ (Т-цитотоксических лимфоцитов) выражали в % от общего числа CD3+ клеток. Рассчитывали безразмерный иммунорегуляторный индекс (ИРИ), представляющий собой отношение количества СD4+/CD8+ лимфоцитов.

Содержание цитокинов (пг/мл): интерлейкины (IL) — IL-10, IL-17A, IL-12p70, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ (интерферон-γ), MCP-1 (моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1), MIP-1α (воспалительный белок макрофагов — 1α), MIP-2 (воспалительный белок макрофагов — 2) и TNF-α (фактор некроза опухоли-α) в плазме крови крыс определяли методом мультиплексного иммуноанализа с использованием базового набора Bio-Plex Pro™ Reagent Kit V, дополняемого реагентами Bio-Plex Pro™ производства фирмы "Bio-Rad Laboratories, Inc." (США) на анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) по технологии xMAP с программным обеспечением Luminex xPONENT Version 3.1. Относительные показатели IL-10/IL-12(p70) и IL-10/IL-17A вычисляли как отношение уровней IL-10 к абсолютным цифрам в плазме крови IL-12(p70) и IL-17A.

Статистический анализ

При статистической обработке результатов использовали пакеты программ Excel 365 и SPSS 20.0. Значения всех определяемых показателей после статистической обработки были представлены в виде средних величин и их стандартной ошибки (M±m), медианы (Me), максимального (max) и минимального (min) значений. Достоверность различий между группами определяли с использованием двустороннего t-теста Стьюдента. Непараметрический ранговый U-критерий Манна-Уитни использовали для проверки гипотезы о различии распределений. Соответствие распределения изучаемых показателей нормальному закону проверяли согласно непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова. Различия признавались достоверными (нуль-гипотеза отвергалась) на уровне значимости р<0,05.

Соответствие нормам этики

Исследование получило одобрение Этического комитета ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» и осуществлялось в соответствии с рекомендациями ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами».

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Оценка влияния капсаициноидов на показатели клеточного иммунитета крыс

Результаты общего анализа крови свидетельствуют о наличии лейкоцитоза у крыс 2‑й группы, потреблявшей ВКХДР, за счет повышения уровней нейтрофильных лейкоцитов (1,20±0,13 vs 0,72±0,07 х10⁹/л; р<0,05) и лимфоцитов (8,78±0,95 vs 7,37±0,89 х10⁹/л; р<0,05) по сравнению с данными показателями у крыс контрольной группы. Внутрижелудочное введение крысам 3‑й группы капсаициноидов привело к снижению уровней нейтрофилов и лимфоцитов, которые не отличались от показателей контрольной группы (нейтрофилы — 0,98±0,15 vs 0,72±0,07 х10⁹/л; лимфоциты — 7,76±0,55 vs 7,37±0,89, х10⁹/л). Данные исследования клеточного иммунитета крыс представлены в таблице 1.

Как следует из представленных в таблице 1 данных, потребление крысами ВКХДР привело к развитию воспалительного процесса, о чем свидетельствует статистически достоверное (р<0,05) повышение относительного содержания Т-хелперов и величины ИРИ (0,05<р<0,10) по сравнению с показателями контрольной группы. Внутрижелудочное введение крысам капсаициноидов в 3‑й группе инициировало снижение (р<0,05) процента Т-хелперов в периферической крови относительно величины данного показателя у крыс 2‑й группы до уровня, не имеющего достоверного различия с показателем крыс 1‑й группы. На популяцию В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-цитотоксических лимфоцитов и NK-клеток потребление крысами ВКХДР и введение капсаициноидов не оказало существенного влияния.

2. Оценка влияния капсаициноидов на цитокиновый профиль плазмы крови крыс

Употребление животными ВКХДР привело к повышению в плазме крови уровней IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-10, IL-17A, и MCP-1 по сравнению с контрольной группой (рис. 1; p<0,05). Напротив, уровни IL-2 и TNF-α при тех же условиях содержания животных достоверно снизились (рис. 1; p<0,05). Содержание остальных цитокинов (IL-4, IL-6, IL-12(p70), MIP-1α и MIP-2) во 2‑й группе крыс достоверно не изменились по сравнению с 1‑й группой. Кормление животных 2‑й группы ВКХДР также не оказало влияния на величину соотношения уровня IL-10 в плазме крови к уровню IL-12(p70) по сравнению со значениями в контрольной группе (табл. 2). Показателем активности регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) является соотношение уровней IL-10/17A, которое у крыс с алиментарным ожирением уменьшилось более чем в два раза по сравнению с контрольной группой (табл. 2; p<0,05).

Внутрижелудочное введение капсаициноидов крысам, потреблявшим ВКХДР (3‑я гр.), вызвало изменения уровней цитокинов в плазме крови как по сравнению с контролем, так и со 2‑й группой крыс, которых содержали на ВКХДР. Достоверно выросли уровни IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17A, MIP-1α и TNF-α (рис. 2а; p<0,05). Напротив, введение крысам капсаициноидов снизило в плазме крови значения IL-12(p70) и MIP-2 по сравнению со 2‑й и 1‑й группами животных (рис. 2б; p<0,05). За счет этого влияния значимо увеличилось соотношение уровня IL-10 к IL-12(p70), но оставалась достоверно меньше контрольного значения медиана IL-10/17A (табл. 2; p<0,05). Введение животным капсаициноидов не оказало значимого влияния на повышенные уровни IL-1β, IFN-γ и MCP-1 (рис. 2б), а также на показатель IL-10/17A, которые статистически не отличались от значений во 2‑й группе (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Характерные метаболические нарушения, которые формируются при ожирении, являются патогенетическим фактором развития хронического вялотекущего системного воспаления — метавоспаления, которое является причиной иммунной дисфункции [24]. Наличие выраженного лейкоцитоза за счет повышения содержания нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов, рост относительного содержания в периферической крови Т-хелперов с соответствующим повышением величины ИРИ у крыс 2‑й группы, потреблявших ВКХДР (табл. 1), свидетельствует о наличии воспалительного процесса [25]. Введение крысам 3‑й группы капсаициноидов привело к нормализации данных показателей.

Полученные результаты определения уровней цитокинов (табл. 2, рис. 1, 2) у животных, потреблявших ВКХДР, подтверждают тесную взаимосвязь нарушений метаболического гомеостаза с изменениями в иммунной системе. Иммунная система регулирует механизмы развития метавоспаления как на системном уровне, так и в очагах полиорганного адипогенеза, и обеспечивает прогрессирование метаболических расстройств [26][27]. Запуск сигнальных путей провоспалительных цитокинов за счет преобладания активированных Th1 (Т-хелперов 1 типа) и трижды позитивных (F4/80+, CD11b+ и CD11c+) M1 макрофагов, мигрирующих в области избыточного роста жировой ткани, способствует нарастанию экспрессии провоспалительных и супрессорных факторов [28]. Этот процесс является основой для формирования резистентности организма к инсулину. При этом спектр изменений цитокиновых профилей как на тканевом уровне, так и системно во многом зависит от моделей исследования, состава высококалорийных рационов и длительности периода исследований [29][30]. В частности, уровни многих цитокинов в крови крыс могут как резко возрастать, так и достаточно значимо снижаться, что было продемонстрировано в наших предыдущих исследованиях [19][31] и отражено в литературных обзорах, отражающих механизмы нарушений иммунорегуляции при ожирении и метаболическом синдроме [29][30]. В подтверждение вышеизложенного в нашем исследовании на фоне потребления крысами ВКХДР обнаружен достоверный рост уровней провоспалительных цитокинов: IFN-γ, IL-1β, IL-17A, и MCP-1 в плазме крови. Несмотря на повышение содержания IL-5 и IL-10, уменьшение Me соотношения IL-10/17A (табл. 2; p<0,05) можно расценивать как супрессию активности Treg-популяций лимфоцитов и механизмов противовоспалительного потенциала иммунной системы.

Установлено, что основной причиной иммунной дисфункции является прогрессирующее снижение чувствительности клеток, в том числе эффекторов иммунной системы, к инсулину. В клинических исследованиях и работах in vitro показано супрессорное влияние гипергликемии на продукцию цитокинов. Так, в культуре мононуклеаров периферической крови, находившихся в среде с повышенным уровнем глюкозы, выделенных у больных с ожирением и лиц без метаболических нарушений, обнаружены значительные различия в их способности к синтезу цитокинов [32][33]. Основными путями передачи сигналов инсулина являются митогенный и метаболический, которые осуществляются по механизмам обратной связи, которые могут быть как положительными, так и отрицательными. Нарушения в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриальная дисфункция и окислительный стресс являются следствием нарушения передачи сигнала от инсулинового рецептора к его мишеням по механизму отрицательной обратной связи во внутриклеточных инсулинзависимых сигнальных каскадах [26][27]. Инсулиновый каскад включает рецептор инсулина (INSR), субстрат инсулинового рецептора (белок IRS), PI3-киназный каскад и систему активации глюкозного транспортера Glut-4 [34]. При ожирении большинство цитокинов снижают чувствительность тканей к инсулину путем активации ряда киназ: NF-κB (транскрипционный ядерный фактор каппа В), IKK (ингибитор κB киназы), JNK (c-Jun N-терминальная киназа). Указанные киназы используют IRS как один из субстратов, фосфорилируя его по нескольким сериновым остаткам, переводя в неактивное состояние и прерывая передачу сигнала по инсулиновому каскаду [26][27].

Внутрижелудочное введение крысам с алиментарным ожирением капсаициноидов изменяет цитокиновый профиль с преобладанием регуляторных и противовоспалительных факторов: IL-2, IL-4, IL-5 и IL-10. В первую очередь возрастает до контрольных значений уровень основного регулятора пролиферации и дифференцировки Т-клеток — IL-2 (рис. 2а), секреция которого подавляется при избытке калорий, гиперлипидемии и резистентности к инсулину [32][33]. О возможной супрессии капсаициноидами механизмов регуляции метавоспаления в собственно жировой ткани и дистрофически измененных неадипозных органах свидетельствует достоверный рост уровня IL-10 с активацией Th2 (Т-хелперы 2 типа)-зависимых реакций и увеличением в плазме крови уровней IL-4 и IL-5 (рис. 2а). Подтверждением этих процессов становится значительное увеличение (p<0,05) соотношения IL-10/IL-12(p70) и положительная динамика показателя IL-10/IL-17A (табл. 2). Эти изменения происходят вследствие выраженного уменьшения в плазме крови животных 3‑й группы IL-12(p70) и значительно меньшего увеличения уровня IL-17A по сравнению с IL-10. Соотношение медиан показателей у животных 3‑й группы ко 2‑й группе (Me3/Me2) для IL-10 составило 1,9, а для IL-17A — 1,3. Очевидно, что капсаициноиды, обладая способностью модулировать внутриклеточные киназы, оказывают влияние на активацию и реализацию функций иммунокомпетентных клеток. Это, по-видимому, позволяет капсаициноидам участвовать в контроле над развитием и функционированием T reg, Th1 и Th17 (Т-хелперы17) лимфоцитов [35]. Напротив, у крыс 2‑й группы обнаружен более выраженный рост уровня IL-17A (Me2/Me1 — 3,4) по сравнению с IL-10 (Me2/Me1 — 1,4) и, соответственно, достоверно сниженный показатель IL-10/IL-17A (табл. 2).

Иммунорегуляторное влияние капсаицина активно изучается. Установлено, что капсаицин является потенциальным агонистом ваниллоидного рецептора 1 (TRPV1) и может рассматриваться как биологически активное вещество, влияющее на термогенез в терапии ожирения [9][10]. TRPV1 также играет важную роль в регуляции метаболизма, в том числе углеводного и липидного обмена, что оказывает существенное влияние на массу тела и состояние сердечно-сосудистой системы [36][37]. Активация TRPV1 капсаициноидами может нормализовать гомеостаз глюкозы за счет стимуляции секреции инсулина и повышения уровня GLP-1 (глюкагоноподобный пептид-1) [38]. Кроме того, на модели алиментарного ожирения у мышей показано, что капсаицин может модулировать функцию адипоцитов и подавлять провоспалительную активность макрофагов жировой ткани путем инактивации ядерного фактора-κB (NF-κB) и активацией рецептора, активируемого пролифератором пероксисом-γ (PPAR-γ) [39]. В результате происходит угнетение адипогенеза, уменьшается миграция макрофагов и снижается интенсивность воспалительных реакции в жировой ткани [9][10]. TRPV1 широко экспрессируется в различных тканях у млекопитающих и обнаружен на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, лимфоцитах, NK-клетках и нейтрофилах. Таким образом, капсаицин потенциально может влиять на все эффекторные звенья метавоспаления при ожирении и, в том числе, на их секреторную активность, модулируя экспрессию цитокинов, хемокинов и способность клеток к фагоцитозу и миграции [35][40]. Результаты нашего исследования свидетельствуют об изменении в плазме крови крыс 3‑й группы уровней как цитокинов: IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-12(p70) и TNF-α, так и хемокинов MIP-1α и MIP-2 (рис. 2а, б). Однако, аналогичного влияния на уровни IL-1β, IFN-γ и MCP-1 при введении крысам капсаициноидов в проведенном исследовании обнаружено не было (рис. 2б). Уровни перечисленных факторов в 3‑й группе животных достоверно не отличались от показателей во 2‑й группе, но оставались достоверно выше, чем в контроле. В то же время снизились уровни провоспалительных факторов IL-12(p70) и MIP-2 (рис. 2б; p<0,05). Таким образом, обнаруженное в нашем исследовании индуцированное введением капсаициноидов повышение уровней таких цитокинов, как IL-4, IL-5, IL-10, торможение дальнейшего роста содержания в плазме крови IL-1β, IFN-γ и MCP-1 и достоверное уменьшение IL-12(p70) и MIP-2 может ослаблять/отменять провоцируемое ожирением комплексное возлействие цитокинов: IL-1β, IL-6, IL-12(p70), IFN-γ, TNF-α, MIP-2 и MCP-1, снижающих чувствительность тканей к инсулину в результате нарушений передачи сигналов по инсулиновому каскаду.

Клиническая значимость результатов

Полученные данные свидетельствуют о перспективе использования капсаициноидов для снижения активности воспалительного процесса при ожирении.

Направления дальнейших исследований

Результаты исследования свидетельствуют о перспективе дальнейшего изучения и научного обоснования применения капсаициноидов в качестве дополнительного средства диетотерапии пациентов с избыточной массой тела и ожирением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У крыс с алиментарным ожирением установлено наличие метавоспаления, маркерами которого являются нейтрофильный лейкоцитоз и лимфоцитоз с повышением относительного содержания Т-хелперов, повышенный уровень провоспалительных цитокинов и факторов роста. Внутрижелудочное введение крысам капсаициноидов нормализует лейкоцитарные показатели и субпопуляционный уровень Т-лимфоцитов. Капсаициноиды, являясь прямыми активаторами TRPV1, оказывают существенное влияние на цитокиновую сеть, обеспечивая торможение или отмену передачи сигналов по воспалительным каскадам, регулируемым с участием IKK/NF-κB и JNK-киназ. Таким образом, установлено противовоспалительное действие исследованных капсаициноидов экстракта острого стручкового перца при алиментарном ожирении у крыс.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема № FGMF-2022-0003).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Существенный вклад: в концепцию или дизайн исследования — Тутельян В.А., Аксенов И.В., в получение, анализ данных и интерпретацию результатов — Трушина Э.Н., Ригер Н.А., Мустафина О.К., Тимонин А.Н., в написание статьи или внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи — Трушина Э.Н., Ригер Н.А., Тутельян В.А. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы выражают глубокую благодарность сотрудникам ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»: Гусевой Г.В., Трусову Н.В., Авреньевой Л.И. и Балакиной А.С. за помощь в проведении исследований.