Ожирение и избыточная масса тела занимают одно из ведущих мест в мире и являются серьезной проблемой здравоохранения. Результаты исследований механизмов нарушения метаболизма при ожирении убедительно показывают, что иммунная система принимает активное участие в регуляции обмена веществ [1]. С одной стороны, это сохранение целостности органов и тканей, контролирующих метаболизм, с другой — влияние метаболического статуса организма на эффекторные способности самих иммунных клеток [2]. Взаимосвязь метаболизма и иммунитета на системном и клеточном уровнях в настоящее время активно изучается и определяется как иммунометаболизм [3]. Воспалительный процесс в жировой ткани опосредован как дисфункциональными адипоцитами, которые секретируют провоспалительные адипокины, так и иммунными клетками, экспрессирующими цитокины и хемокины [4]. Установлено, что при ожирении, помимо жировой ткани, активированные иммунные клетки инфильтрируют скелетные мышцы, головной мозг, кишечник, поджелудочную железу [5]. Наличие хронического вялотекущего системного воспаления при ожирении доказывают обнаруженные корреляционные взаимосвязи между субпопуляциями лимфоцитов, метаболическими нарушениями и клиническими проявлениями [6]. Помимо лимфоцитов, существенную роль в поддержании воспалительного процесса (метавоспаления) играет активация макрофагов, дендритных клеток, NK-клеток (естественные киллеры) и других клеток, экспрессирующих медиаторы воспаления [7]. Установлено, что цитокины вносят существенный вклад в развитие нарушений метаболизма глюкозы и липидов. Задействованные механизмы до конца не изучены, но имеются данные, подтверждающие взаимосвязь цитокинового профиля с накоплением липидов в органах и тканях, включая жировую ткань и печень, изменениями в энергетическом обмене и экспрессией провоспалительных сигналов, поступающих от различных типов клеток, включая иммунные. Изменения уровней циркулирующих цитокинов могут служить биомаркерами для раннего выявления метаболических нарушений [8].

В настоящее время особую актуальность приобретают разработка и внедрение новых методов в терапии ожирения, которые должны быть эффективными, безопасными и широко доступными. Применение биологически активных веществ, полученных из растительного сырья, позволяет сформировать комплексный подход в терапии данной патологии [9, 10]. Капсаициноиды, в том числе капсаицин, являются биологически активными веществами, содержащимися в различных видах стручкового перца Capsicum. Капсаицин активно применяется в терапии ожирения, сердечно-сосудистой патологии, онкологических заболеваний в качестве обезболивающего, противовоспалительного, антиоксидантного, антиканцерогенного средства [11–13]. К основным механизмам, лежащим в основе положительного влияния капсаицина в терапии ожирения, относят повышение чувства насыщения и снижение аппетита, регулируемые гипоталамусом, положительное влияние на функцию желудочно-кишечного тракта и кишечный микробиом, усиление термогенеза и активация процессов окисления липидов [14–17]. Подтверждением этого может служить экспериментальное исследование на мышах C57BL/6J, получавших высокожировой рацион [18]. Пероральное введение гранул капсаицина, оказало статистически значимое влияние на биомаркеры ожирения за счет увеличения содержания адипонектина и снижения уровней лептина, свободных жирных кислот и инсулина в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой мышей, потреблявших стандартный рацион. В исследованных группах не было отмечено изменений массы печени, при этом наблюдалось значительное снижение количества белой жировой ткани у мышей основной группы. Несмотря на большое количество исследований, опубликованных в оригинальных статьях и обзорах, посвященных механизмам протективного влияния капсаициноидов на метаболические процессы при ожирении, вопрос иммуномодулирующего влияния данных биологически активных веществ остается открытым.

Изучить влияния капсаициноидов на иммунный статус на модели алиментарного ожирения у крыс.

Место проведения. Виварий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии».

Время исследования. Эксперимент проведен с 27 сентября по 21 ноября 2023 г.

Изучаемые популяции — изучалась одна популяция.

Критерии включения: для участия в эксперименте были выбраны крысы-самцы линии Wistar с исходной массой тела 350±10 г.

Критерии исключения: не применялись.

Способ формирования выборки — произвольный.

Данное исследование было одноцентровое, экспериментальное, одномоментное, одновыборочное сравнительное, контролируемое, рандомизированное.

Эксперимент проводили в течение 8 недель на 3-х группах крыс самцов линии Wistar (по 10 животных, исходная масса тела 350±10 г), полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА». Животных содержали по 2 особи в пластиковых клетках на подстилке из древесных стружек при искусственном освещении с равной продолжительностью ночного и дневного периодов. Крысы получали полусинтетический стандартный рацион (группа 1) и высококалорийный холинодефицитный рацион (ВКХДР) (группы 2 и 3, ad libitum) [19]. Животным внутрижелудочно (3,33 мл/кг массы тела) вводили 3 раза в неделю подсолнечное масло (группы 1 и 2) и экстракт острого стручкового перца (капсаицин — 59%, дигидрокапсаицин — 31%, нордигидрокапсаицин — 4%; Hunan Insen Biotech Co., Ltd., КНР) в подсолнечном масле (группа 3) в разовой дозе 15 мг капсаициноидов/кг массы тела. Данная дозировка в пересчете [20] приближается к верхнему уровню возможного поступления капсаициноидов с рационом человека [21] и находится в диапазоне доз, используемых в экспериментах на животных и клинических исследованиях на добровольцах [22][23].

Гематологические исследования выполняли на гематологическом анализаторе Coulter ACT TM 5 diff OV (Beckman Coulter, США) с использованием реактивов производства этой же фирмы. Экспрессию рецепторов CD45R, CD3, CD4, CD8а, CD161 на лимфоцитах периферической крови крыс определяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, коньюгированных с флуоресцентными красителями: APC, FITC, РЕ («Miltenyi Biotec GmbH», Германия). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, США). Содержание CD45R+ клеток (B-лимфоциты), CD3+ (Т-лимфоциты) и CD161+ (NK-клетки) выражали в % от общего числа проанализированных клеток; содержание CD3+CD4+ (Т-хелперов) и CD3+CD8+ (Т-цитотоксических лимфоцитов) выражали в % от общего числа CD3+ клеток. Рассчитывали безразмерный иммунорегуляторный индекс (ИРИ), представляющий собой отношение количества СD4+/CD8+ лимфоцитов.

Содержание цитокинов (пг/мл): интерлейкины (IL) — IL-10, IL-17A, IL-12p70, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ (интерферон-γ), MCP-1 (моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1), MIP-1α (воспалительный белок макрофагов — 1α), MIP-2 (воспалительный белок макрофагов — 2) и TNF-α (фактор некроза опухоли-α) в плазме крови крыс определяли методом мультиплексного иммуноанализа с использованием базового набора Bio-Plex Pro™ Reagent Kit V, дополняемого реагентами Bio-Plex Pro™ производства фирмы "Bio-Rad Laboratories, Inc." (США) на анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) по технологии xMAP с программным обеспечением Luminex xPONENT Version 3.1. Относительные показатели IL-10/IL-12(p70) и IL-10/IL-17A вычисляли как отношение уровней IL-10 к абсолютным цифрам в плазме крови IL-12(p70) и IL-17A.

При статистической обработке результатов использовали пакеты программ Excel 365 и SPSS 20.0. Значения всех определяемых показателей после статистической обработки были представлены в виде средних величин и их стандартной ошибки (M±m), медианы (Me), максимального (max) и минимального (min) значений. Достоверность различий между группами определяли с использованием двустороннего t-теста Стьюдента. Непараметрический ранговый U-критерий Манна-Уитни использовали для проверки гипотезы о различии распределений. Соответствие распределения изучаемых показателей нормальному закону проверяли согласно непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова. Различия признавались достоверными (нуль-гипотеза отвергалась) на уровне значимости р<0,05.

Исследование получило одобрение Этического комитета ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» и осуществлялось в соответствии с рекомендациями ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами».

Результаты общего анализа крови свидетельствуют о наличии лейкоцитоза у крыс 2‑й группы, потреблявшей ВКХДР, за счет повышения уровней нейтрофильных лейкоцитов (1,20±0,13 vs 0,72±0,07 х10⁹/л; р<0,05) и лимфоцитов (8,78±0,95 vs 7,37±0,89 х10⁹/л; р<0,05) по сравнению с данными показателями у крыс контрольной группы. Внутрижелудочное введение крысам 3‑й группы капсаициноидов привело к снижению уровней нейтрофилов и лимфоцитов, которые не отличались от показателей контрольной группы (нейтрофилы — 0,98±0,15 vs 0,72±0,07 х10⁹/л; лимфоциты — 7,76±0,55 vs 7,37±0,89, х10⁹/л). Данные исследования клеточного иммунитета крыс представлены в таблице 1.

Как следует из представленных в таблице 1 данных, потребление крысами ВКХДР привело к развитию воспалительного процесса, о чем свидетельствует статистически достоверное (р<0,05) повышение относительного содержания Т-хелперов и величины ИРИ (0,05<р<0,10) по сравнению с показателями контрольной группы. Внутрижелудочное введение крысам капсаициноидов в 3‑й группе инициировало снижение (р<0,05) процента Т-хелперов в периферической крови относительно величины данного показателя у крыс 2‑й группы до уровня, не имеющего достоверного различия с показателем крыс 1‑й группы. На популяцию В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-цитотоксических лимфоцитов и NK-клеток потребление крысами ВКХДР и введение капсаициноидов не оказало существенного влияния.

Употребление животными ВКХДР привело к повышению в плазме крови уровней IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-10, IL-17A, и MCP-1 по сравнению с контрольной группой (рис. 1; p<0,05). Напротив, уровни IL-2 и TNF-α при тех же условиях содержания животных достоверно снизились (рис. 1; p<0,05). Содержание остальных цитокинов (IL-4, IL-6, IL-12(p70), MIP-1α и MIP-2) во 2‑й группе крыс достоверно не изменились по сравнению с 1‑й группой. Кормление животных 2‑й группы ВКХДР также не оказало влияния на величину соотношения уровня IL-10 в плазме крови к уровню IL-12(p70) по сравнению со значениями в контрольной группе (табл. 2). Показателем активности регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) является соотношение уровней IL-10/17A, которое у крыс с алиментарным ожирением уменьшилось более чем в два раза по сравнению с контрольной группой (табл. 2; p<0,05).

Внутрижелудочное введение капсаициноидов крысам, потреблявшим ВКХДР (3‑я гр.), вызвало изменения уровней цитокинов в плазме крови как по сравнению с контролем, так и со 2‑й группой крыс, которых содержали на ВКХДР. Достоверно выросли уровни IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17A, MIP-1α и TNF-α (рис. 2а; p<0,05). Напротив, введение крысам капсаициноидов снизило в плазме крови значения IL-12(p70) и MIP-2 по сравнению со 2‑й и 1‑й группами животных (рис. 2б; p<0,05). За счет этого влияния значимо увеличилось соотношение уровня IL-10 к IL-12(p70), но оставалась достоверно меньше контрольного значения медиана IL-10/17A (табл. 2; p<0,05). Введение животным капсаициноидов не оказало значимого влияния на повышенные уровни IL-1β, IFN-γ и MCP-1 (рис. 2б), а также на показатель IL-10/17A, которые статистически не отличались от значений во 2‑й группе (табл. 2).

Характерные метаболические нарушения, которые формируются при ожирении, являются патогенетическим фактором развития хронического вялотекущего системного воспаления — метавоспаления, которое является причиной иммунной дисфункции [24]. Наличие выраженного лейкоцитоза за счет повышения содержания нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов, рост относительного содержания в периферической крови Т-хелперов с соответствующим повышением величины ИРИ у крыс 2‑й группы, потреблявших ВКХДР (табл. 1), свидетельствует о наличии воспалительного процесса [25]. Введение крысам 3‑й группы капсаициноидов привело к нормализации данных показателей.

Полученные результаты определения уровней цитокинов (табл. 2, рис. 1, 2) у животных, потреблявших ВКХДР, подтверждают тесную взаимосвязь нарушений метаболического гомеостаза с изменениями в иммунной системе. Иммунная система регулирует механизмы развития метавоспаления как на системном уровне, так и в очагах полиорганного адипогенеза, и обеспечивает прогрессирование метаболических расстройств [26][27]. Запуск сигнальных путей провоспалительных цитокинов за счет преобладания активированных Th1 (Т-хелперов 1 типа) и трижды позитивных (F4/80+, CD11b+ и CD11c+) M1 макрофагов, мигрирующих в области избыточного роста жировой ткани, способствует нарастанию экспрессии провоспалительных и супрессорных факторов [28]. Этот процесс является основой для формирования резистентности организма к инсулину. При этом спектр изменений цитокиновых профилей как на тканевом уровне, так и системно во многом зависит от моделей исследования, состава высококалорийных рационов и длительности периода исследований [29][30]. В частности, уровни многих цитокинов в крови крыс могут как резко возрастать, так и достаточно значимо снижаться, что было продемонстрировано в наших предыдущих исследованиях [19][31] и отражено в литературных обзорах, отражающих механизмы нарушений иммунорегуляции при ожирении и метаболическом синдроме [29][30]. В подтверждение вышеизложенного в нашем исследовании на фоне потребления крысами ВКХДР обнаружен достоверный рост уровней провоспалительных цитокинов: IFN-γ, IL-1β, IL-17A, и MCP-1 в плазме крови. Несмотря на повышение содержания IL-5 и IL-10, уменьшение Me соотношения IL-10/17A (табл. 2; p<0,05) можно расценивать как супрессию активности Treg-популяций лимфоцитов и механизмов противовоспалительного потенциала иммунной системы.

Установлено, что основной причиной иммунной дисфункции является прогрессирующее снижение чувствительности клеток, в том числе эффекторов иммунной системы, к инсулину. В клинических исследованиях и работах in vitro показано супрессорное влияние гипергликемии на продукцию цитокинов. Так, в культуре мононуклеаров периферической крови, находившихся в среде с повышенным уровнем глюкозы, выделенных у больных с ожирением и лиц без метаболических нарушений, обнаружены значительные различия в их способности к синтезу цитокинов [32][33]. Основными путями передачи сигналов инсулина являются митогенный и метаболический, которые осуществляются по механизмам обратной связи, которые могут быть как положительными, так и отрицательными. Нарушения в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриальная дисфункция и окислительный стресс являются следствием нарушения передачи сигнала от инсулинового рецептора к его мишеням по механизму отрицательной обратной связи во внутриклеточных инсулинзависимых сигнальных каскадах [26][27]. Инсулиновый каскад включает рецептор инсулина (INSR), субстрат инсулинового рецептора (белок IRS), PI3-киназный каскад и систему активации глюкозного транспортера Glut-4 [34]. При ожирении большинство цитокинов снижают чувствительность тканей к инсулину путем активации ряда киназ: NF-κB (транскрипционный ядерный фактор каппа В), IKK (ингибитор κB киназы), JNK (c-Jun N-терминальная киназа). Указанные киназы используют IRS как один из субстратов, фосфорилируя его по нескольким сериновым остаткам, переводя в неактивное состояние и прерывая передачу сигнала по инсулиновому каскаду [26][27].

Внутрижелудочное введение крысам с алиментарным ожирением капсаициноидов изменяет цитокиновый профиль с преобладанием регуляторных и противовоспалительных факторов: IL-2, IL-4, IL-5 и IL-10. В первую очередь возрастает до контрольных значений уровень основного регулятора пролиферации и дифференцировки Т-клеток — IL-2 (рис. 2а), секреция которого подавляется при избытке калорий, гиперлипидемии и резистентности к инсулину [32][33]. О возможной супрессии капсаициноидами механизмов регуляции метавоспаления в собственно жировой ткани и дистрофически измененных неадипозных органах свидетельствует достоверный рост уровня IL-10 с активацией Th2 (Т-хелперы 2 типа)-зависимых реакций и увеличением в плазме крови уровней IL-4 и IL-5 (рис. 2а). Подтверждением этих процессов становится значительное увеличение (p<0,05) соотношения IL-10/IL-12(p70) и положительная динамика показателя IL-10/IL-17A (табл. 2). Эти изменения происходят вследствие выраженного уменьшения в плазме крови животных 3‑й группы IL-12(p70) и значительно меньшего увеличения уровня IL-17A по сравнению с IL-10. Соотношение медиан показателей у животных 3‑й группы ко 2‑й группе (Me3/Me2) для IL-10 составило 1,9, а для IL-17A — 1,3. Очевидно, что капсаициноиды, обладая способностью модулировать внутриклеточные киназы, оказывают влияние на активацию и реализацию функций иммунокомпетентных клеток. Это, по-видимому, позволяет капсаициноидам участвовать в контроле над развитием и функционированием T reg, Th1 и Th17 (Т-хелперы17) лимфоцитов [35]. Напротив, у крыс 2‑й группы обнаружен более выраженный рост уровня IL-17A (Me2/Me1 — 3,4) по сравнению с IL-10 (Me2/Me1 — 1,4) и, соответственно, достоверно сниженный показатель IL-10/IL-17A (табл. 2).

Иммунорегуляторное влияние капсаицина активно изучается. Установлено, что капсаицин является потенциальным агонистом ваниллоидного рецептора 1 (TRPV1) и может рассматриваться как биологически активное вещество, влияющее на термогенез в терапии ожирения [9][10]. TRPV1 также играет важную роль в регуляции метаболизма, в том числе углеводного и липидного обмена, что оказывает существенное влияние на массу тела и состояние сердечно-сосудистой системы [36][37]. Активация TRPV1 капсаициноидами может нормализовать гомеостаз глюкозы за счет стимуляции секреции инсулина и повышения уровня GLP-1 (глюкагоноподобный пептид-1) [38]. Кроме того, на модели алиментарного ожирения у мышей показано, что капсаицин может модулировать функцию адипоцитов и подавлять провоспалительную активность макрофагов жировой ткани путем инактивации ядерного фактора-κB (NF-κB) и активацией рецептора, активируемого пролифератором пероксисом-γ (PPAR-γ) [39]. В результате происходит угнетение адипогенеза, уменьшается миграция макрофагов и снижается интенсивность воспалительных реакции в жировой ткани [9][10]. TRPV1 широко экспрессируется в различных тканях у млекопитающих и обнаружен на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, лимфоцитах, NK-клетках и нейтрофилах. Таким образом, капсаицин потенциально может влиять на все эффекторные звенья метавоспаления при ожирении и, в том числе, на их секреторную активность, модулируя экспрессию цитокинов, хемокинов и способность клеток к фагоцитозу и миграции [35][40]. Результаты нашего исследования свидетельствуют об изменении в плазме крови крыс 3‑й группы уровней как цитокинов: IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-12(p70) и TNF-α, так и хемокинов MIP-1α и MIP-2 (рис. 2а, б). Однако, аналогичного влияния на уровни IL-1β, IFN-γ и MCP-1 при введении крысам капсаициноидов в проведенном исследовании обнаружено не было (рис. 2б). Уровни перечисленных факторов в 3‑й группе животных достоверно не отличались от показателей во 2‑й группе, но оставались достоверно выше, чем в контроле. В то же время снизились уровни провоспалительных факторов IL-12(p70) и MIP-2 (рис. 2б; p<0,05). Таким образом, обнаруженное в нашем исследовании индуцированное введением капсаициноидов повышение уровней таких цитокинов, как IL-4, IL-5, IL-10, торможение дальнейшего роста содержания в плазме крови IL-1β, IFN-γ и MCP-1 и достоверное уменьшение IL-12(p70) и MIP-2 может ослаблять/отменять провоцируемое ожирением комплексное возлействие цитокинов: IL-1β, IL-6, IL-12(p70), IFN-γ, TNF-α, MIP-2 и MCP-1, снижающих чувствительность тканей к инсулину в результате нарушений передачи сигналов по инсулиновому каскаду.

Полученные данные свидетельствуют о перспективе использования капсаициноидов для снижения активности воспалительного процесса при ожирении.

Результаты исследования свидетельствуют о перспективе дальнейшего изучения и научного обоснования применения капсаициноидов в качестве дополнительного средства диетотерапии пациентов с избыточной массой тела и ожирением.

У крыс с алиментарным ожирением установлено наличие метавоспаления, маркерами которого являются нейтрофильный лейкоцитоз и лимфоцитоз с повышением относительного содержания Т-хелперов, повышенный уровень провоспалительных цитокинов и факторов роста. Внутрижелудочное введение крысам капсаициноидов нормализует лейкоцитарные показатели и субпопуляционный уровень Т-лимфоцитов. Капсаициноиды, являясь прямыми активаторами TRPV1, оказывают существенное влияние на цитокиновую сеть, обеспечивая торможение или отмену передачи сигналов по воспалительным каскадам, регулируемым с участием IKK/NF-κB и JNK-киназ. Таким образом, установлено противовоспалительное действие исследованных капсаициноидов экстракта острого стручкового перца при алиментарном ожирении у крыс.

Источники финансирования. Работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема № FGMF-2022-0003).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Существенный вклад: в концепцию или дизайн исследования — Тутельян В.А., Аксенов И.В., в получение, анализ данных и интерпретацию результатов — Трушина Э.Н., Ригер Н.А., Мустафина О.К., Тимонин А.Н., в написание статьи или внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи — Трушина Э.Н., Ригер Н.А., Тутельян В.А. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы выражают глубокую благодарность сотрудникам ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»: Гусевой Г.В., Трусову Н.В., Авреньевой Л.И. и Балакиной А.С. за помощь в проведении исследований.