Возврат к стандартному питанию после высококалорийной диеты улучшает метаболические показатели и реактивность аорты крысы

ОБОСНОВАНИЕ

Термин «эпидемия ожирения» уже широко используется для описания распространенности во всем мире и резкого повышения количества людей с избыточной массой тела и ожирением за последние 4 десятилетия. В результате этой неинфекционной эпидемии к настоящему времени около 1/3 взрослого населения планеты имеет избыточную массу тела [1]. В 2019 г. в мире 5,02 млн смертей и 160 млн DALY были связаны с высоким индексом массы тела (ИМТ) [2]. В России, по данным Росстата, количество людей с диагнозом «ожирение» в 2022 г. составило 2 млн 178,6 тыс. человек, из них с диагнозом, установленным впервые в жизни, — 419 тыс. [3].

Исследование причин роста ожирения и его влияния на состояние различных систем организма является важной задачей, решение которой способствует предотвращению его негативных последствий. Ряд исследований выполняют с использованием различных моделей на животных. Метаболические изменения вследствие повышенного накопления жировой ткани, которые проявляются в виде гипергликемии и дислипидемии, могут быть получены как в генетических моделях, так и индуцированы применением различных диет [4]. Среди всех диетоиндуцированных моделей грызунов наилучшим образом имитирует структуру питания человека используемая в последние годы диета кафе (CAF) [5], или иначе называемая диета кафетерия, диета столовой. В отличие от монодиет с высоким содержанием жиров или углеводов, она обеспечивает разнообразие продуктов питания и их гедонистическое потребление, что приводит к достаточно быстрому набору веса и метаболическим сдвигам.

Существует зависимость между сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) и ИМТ: повышенный ИМТ ухудшает большинство факторов риска ССЗ, включая неблагоприятное воздействие на артериальное давление (АД), уровень глюкозы в крови, липидный обмен и воспаление, структуру и функцию сердца [6]. Почти 70% смертей, связанных с высоким ИМТ, происходят из-за ССЗ, причем большая часть из них связана с нарушениями кровотока [2][7]. Это актуализирует решение проблемы, связанной с изучением взаимосвязи морфо-функционального состояния сосудов и метаболическими изменениями, происходящими при ожирении.

Несмотря на использование различных моделей с целью выяснения механизмов, лежащих в основе патофизиологических изменений во время развития ожирения, вопросы, касающиеся процессов, протекающих в организме после окончания диеты, остаются, как правило, вне сферы внимания исследователей. Однако возможность восстановления нарушенных функций представляет не только теоретический, но и большой практический интерес.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить изменения метаболического состояния и реактивности аорты крысы на действие фенилэфрина при использовании высококалорийной диеты (CAF) в течение 6 недель и после нормализации питания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения

Исследование проведено в лаборатории физиологии кровеносной и лимфатической систем института физиологии им. И.П. Павлова РАН; диетные и контрольные животные во время всего экспериментального периода содержались в виварии института.

Время исследования

Календарный период времени — с мая по декабрь 2023 г.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Самцы крыс Wistar в возрасте 10–11 недель (масса тела — от 275 до 350 г) к началу диеты.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

Животные были распределены на 2 группы рандомизированным способом по массе тела: 1 — контрольная (SD) группа, находившаяся на стандартной диете в виде сухого корма, ad libitum, (n=12); 2 группа — получавшая диету кафе (CAF) с высоким содержанием жиров и углеводов (n=12).

Дизайн исследования

Одноцентровое экспериментальное исследование.

Животных SD и CAF групп содержали в стандартных условиях вивария при температуре 20–22 °C и световом режиме 12 ч свет/12 ч темнота, по 3 крысы в одной клетке. Животные CAF группы находились на кафетерийной диете в течение 6 недель, затем одну часть (n=6) подвергали эвтаназии и дальнейшему исследованию реактивности сосудов, оставшуюся часть (Post-CAF) переводили на стандартный корм еще на 6 недель до эвтаназии и миографического исследования. Исследования животных SD группы также были проведены в 2 этапа. Массу тела крыс измеряли еженедельно, с периодичностью в 2–3 недели проводили контроль кормления, на последней неделе исследуемого периода определяли биохимические показатели крови.

Методы

При использовании CAF животным предоставлялся свободный доступ как к высококалорийным продуктам, таким как печенье, чипсы, сдоба и др. [8], калорийность которых была в пределах от 350 до 550 ккал/100 г, так и к стандартному корму (Тосненский комбикормовый завод, Россия), калорийность — 250 ккал/100 г. Также животные CAF группы имели свободный доступ к 10%-ному раствору сахарозы. Применение диеты CAF осуществляли в соответствии с опубликованными рекомендациями [9]; разнообразие пищевого рациона обеспечивало включение в него 4 различных продуктов и их ежедневная замена на другие.

Оценку уровня глюкозы в крови проводили с использованием анализатора AccuCheck Active (Германия) и уровня триглицеридов (ТГ) в крови — анализатора Multicare-in (Италия) с соответствующими тест-полосками. Образцы крови получали из хвостовой вены крыс после 14-часового голодания; перед процедурой кончики хвостов анестезировали с помощью местных анестетиков лидокаина и прилокаина (крем Acriol pro, «Акрихин ХФК» АО, Россия). Для проведения глюкозотолерантного теста (ГТТ), крысам вводили внутрибрюшинно раствор глюкозы из расчета 2 г/кг массы тела, оценивали динамику изменения уровня глюкозы в крови в течение 120 мин и изменение площади под кривой (AUC) «глюкоза–время». При проведении инсулинорезистентного теста (ИРТ) применяли подкожное введение инсулина (Инсуман Рапид ГТ, Sanofi Aventis, Германия) в дозе 0,75 ЕД/кг, измеряли уровни глюкозы в крови в течение 120 мин и затем рассчитывали константу скорости утилизации глюкозы (KITT): KITT=0,693/t1/2 × 100, где t1/2 — время снижения уровня глюкозы до 50% от максимального. Во время проведения тестов уровни глюкозы в крови измеряли перед проведением теста, натощак (0) и после введения глюкозы при ГТТ, либо инсулина при ИРТ на 15, 30, 60, 90, 120 мин.

В качестве критерия оценки висцерального жира была использована масса эпидидимальных жировых подушечек, которые хорошо очерчены и легко извлекаются, что позволяет избежать весовых ошибок, возникающих при заборе всего висцерального жира. Ее определяли путем диссекции и последующего взвешивания в конце эксперимента после умерщвления животного. Эвтаназию животных осуществляли посредством декапитации, после чего иссекали грудную часть аорты для последующего миографического исследования.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных была проведена при использовании программы GraphPad Prizm 8.0.1. Полученные в экспериментах данные были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. В соответствии с результатами этой проверки в дальнейшем были использованы соответствующие параметрические или непараметрические статистические критерии: t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна–Уитни, одно- и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) при последующем post-hoc анализе с поправкой Бонферрони. Полученные данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (SEM). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Этическая экспертиза

Проведение исследования одобрено биоэтической комиссией Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Использование CAF приводило к увеличению потребления корма (рис. 1А) по сравнению с SD, которой наблюдалось с первых дней ее применения. При этом стандартный корм составлял только 1/5 часть использованных продуктов (20,0±7,9%), и его потребление было ниже, чем в контрольной группе: в расчете на одну крысу 6,1±2,2 г в CAF группе vs 26,2±5,3 г в контроле. Необходимо отметить, что учет съеденного высококалорийного корма требовал тщательного отбора остатков пищи среди подстилочного материала.

Увеличение количества и калорийности использованных продуктов приводило к значительному увеличению прихода энергии (рис. 1В). Прерывание диеты и переход к стандартному питанию сопровождались снижением потребления пищи и прихода энергии (рис. 1А, В).

Изменения прихода энергии нашли отражение в изменении массы тела (рис. 2).

Учитывая, что общая масса тела и возраст (CAF vs Post-CAF) различались в исследуемых группах, выбранная для сравнения в качестве показателя степени висцерального ожирения масса эпидидимальных жировых подушечек была использована в относительных единицах (%) от величины массы тела. Этот показатель, а также показатели липидного (уровень ТГ в крови) и углеводного (уровень глюкозы в крови) обмена представлены в табл. 1 и свидетельствуют о развитии признаков метаболического синдрома при нахождении животных на CAF и улучшении состояния после ее прекращения.

Известно, что в осуществлении релаксационных процессов гладких мышц сосудов большую роль играют калиевые каналы. В данной работе была проведена предварительная инкубация препаратов в течение 20 мин. с неселективным блокатором потенциалозависимых К+ каналов — TЭA. Его использование приводило к увеличению максимальной величины ответов на PhE у SD и Post-CAF животных и не влияло на величину ответа в CAF группе. Величина этих изменений, выраженная в процентах, представлена на рис. 4С.

ОБСУЖДЕНИЕ

Решение важной задачи снижения ССЗ и риска смерти, сопряженных с метаболическим синдромом, во многом связано с исследованиями по выяснению механизмов действия факторов, направленных на предупреждение его развития, и соответствующему изменению образа жизни. Однако остается открытым вопрос, насколько обратимыми являются нарушения, индуцированные высококалорийным питанием. В данном исследовании была использована CAF, которая зарекомендовала себя эффективной для создания модели метаболического синдрома у грызунов [9][10]. У животных CAF группы было зарегистрировано увеличение ежедневного потребления корма, а учитывая, что калорийность продуктов, составляющих CAF, превышала калорийность стандартного корма, приход энергии в диетной группе в 2,5 раза превышал таковой в контрольной группе. В высококалорийных монодиетах подобного увеличения количества потребляемой пищи не отмечается, и ряд авторов объясняют произвольную гиперфагию как инициированную вкусом пищи [11] и связывают ее с увеличением выработки дофамина [12]. Увеличение прихода энергии нашло отражение в изменении массы тела: ее возрастание было отмечено уже на 1-й неделе, а начиная со 2-й недели, животные CAF имели достоверно большую массу тела, чем в контроле. После прекращения CAF и перевода крыс на стандартную диету наблюдалось резкое снижение количества потребляемого корма и, соответственно, снижение массы тела. Особенно резко это происходило в течение 1-й недели, в дальнейшем количество потребляемого стандартного корма увеличивалось, но оставалось ниже, чем у крыс контрольной группы. Снижение массы тела было зарегистрировано только в начале Post-CAF периода, после чего отмечалось ее возрастание, однако еженедельный привес был ниже, чем в контроле, что привело к отсутствию статистически значимой разницы в массе тела у животных SD и Post-CAF групп.

В настоящее время в целом ряде исследований показана неоднозначная роль увеличения жировой ткани в метаболических нарушениях, приводящих к дисфункции органов; все чаще используются понятия метаболически «здоровое» и «нездоровое» ожирение [13]. Последнее связывают с избыточным накоплением висцеральной жировой ткани. В данной работе, где в качестве показателя степени висцерального ожирения была использована масса эпидидимальной жировой ткани, было зарегистрировано значительное увеличение ее процентного отношения к массе животного в CAF группе по сравнению с SD и практически возвращение к норме за время Post-CAF периода. Одновременно происходило восстановление метаболических показателей — уровней глюкозы и триглицеридов в крови, инсулинорезистентности, повышенных при CAF. Эти результаты согласуются с данными исследований, где нормализацию веса, содержания висцерального жира и метаболических показателей наблюдали уже через 4 недели после прекращения диеты [5].

Остается актуальным вопрос о механизмах дисфункциональных изменений сосудов, происходящих при длительном высококалорийном питании. Ранее нами было показано, что важная роль в их возникновении принадлежит периваскулярной жировой ткани (ПВЖТ), окружающей аорту, антисократительные свойства которой снижаются при использовании CAF [8]. Дальнейшие исследования взаимосвязи обратимости функциональных нарушений, вызванных диетой, продемонстрированной в данной работе, и состояния ПВЖТ могут дать ключ к пониманию механизмов восстановления сократительной активности сосудов. В литературе имеются данные о том, что у крыс и мышей, находящихся на диетах с высоким содержанием жиров и сахаров, функциональное состояние сосудов и ПВЖТ улучшается при физических нагрузках [17][18]. Это улучшение было зарегистрировано на 6–10 неделях после начала физических нагрузок при продолжающейся высококалорийной диете. В нашем исследовании отказ от использования диеты и переход на стандартный корм уже после 6-й недели приводил к нормализации метаболических показателей и реактивности аорты. Учитывая, что было продемонстрировано [5][19] возвращение к контрольному уровню метаболических показателей и продукции некоторых вазоактивных факторов ЖТ уже после 4 нед. прекращения диеты, необходимы исследования возможности восстановления реактивности сосудов на более ранних сроках и с учетом регионарных особенностей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе продемонстрировано, что высококалорийная диета кафетерия, включающая ультрапереработанные продукты с повышенным содержанием жиров и углеводов, является удобной и адекватной моделью для развития метаболического синдрома у крыс. Через 6 недель ее применения у животных были зарегистрированы висцеральное ожирение, гипергликемия и нарушение толерантности к глюкозе, повышенные уровни тригицеридов в плазме крови. Возврат к нормальному питанию сбалансированным стандартным кормом устранял отмеченные нарушения липидного и углеводного обмена.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке госпрограммы 47 ГП «Научно-технологическое развитие Российской Федерации» (2019–2030), тема 0134-2019-0001.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.