Термин «эпидемия ожирения» уже широко используется для описания распространенности во всем мире и резкого повышения количества людей с избыточной массой тела и ожирением за последние 4 десятилетия. В результате этой неинфекционной эпидемии к настоящему времени около 1/3 взрослого населения планеты имеет избыточную массу тела [1]. В 2019 г. в мире 5,02 млн смертей и 160 млн DALY были связаны с высоким индексом массы тела (ИМТ) [2]. В России, по данным Росстата, количество людей с диагнозом «ожирение» в 2022 г. составило 2 млн 178,6 тыс. человек, из них с диагнозом, установленным впервые в жизни, — 419 тыс. [3].

Исследование причин роста ожирения и его влияния на состояние различных систем организма является важной задачей, решение которой способствует предотвращению его негативных последствий. Ряд исследований выполняют с использованием различных моделей на животных. Метаболические изменения вследствие повышенного накопления жировой ткани, которые проявляются в виде гипергликемии и дислипидемии, могут быть получены как в генетических моделях, так и индуцированы применением различных диет [4]. Среди всех диетоиндуцированных моделей грызунов наилучшим образом имитирует структуру питания человека используемая в последние годы диета кафе (CAF) [5], или иначе называемая диета кафетерия, диета столовой. В отличие от монодиет с высоким содержанием жиров или углеводов, она обеспечивает разнообразие продуктов питания и их гедонистическое потребление, что приводит к достаточно быстрому набору веса и метаболическим сдвигам.

Существует зависимость между сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) и ИМТ: повышенный ИМТ ухудшает большинство факторов риска ССЗ, включая неблагоприятное воздействие на артериальное давление (АД), уровень глюкозы в крови, липидный обмен и воспаление, структуру и функцию сердца [6]. Почти 70% смертей, связанных с высоким ИМТ, происходят из-за ССЗ, причем большая часть из них связана с нарушениями кровотока [2][7]. Это актуализирует решение проблемы, связанной с изучением взаимосвязи морфо-функционального состояния сосудов и метаболическими изменениями, происходящими при ожирении.

Несмотря на использование различных моделей с целью выяснения механизмов, лежащих в основе патофизиологических изменений во время развития ожирения, вопросы, касающиеся процессов, протекающих в организме после окончания диеты, остаются, как правило, вне сферы внимания исследователей. Однако возможность восстановления нарушенных функций представляет не только теоретический, но и большой практический интерес.

Оценить изменения метаболического состояния и реактивности аорты крысы на действие фенилэфрина при использовании высококалорийной диеты (CAF) в течение 6 недель и после нормализации питания.

Место проведения

Исследование проведено в лаборатории физиологии кровеносной и лимфатической систем института физиологии им. И.П. Павлова РАН; диетные и контрольные животные во время всего экспериментального периода содержались в виварии института.

Время исследования

Календарный период времени — с мая по декабрь 2023 г.

Самцы крыс Wistar в возрасте 10–11 недель (масса тела — от 275 до 350 г) к началу диеты.

Животные были распределены на 2 группы рандомизированным способом по массе тела: 1 — контрольная (SD) группа, находившаяся на стандартной диете в виде сухого корма, ad libitum, (n=12); 2 группа — получавшая диету кафе (CAF) с высоким содержанием жиров и углеводов (n=12).

Одноцентровое экспериментальное исследование.

Животных SD и CAF групп содержали в стандартных условиях вивария при температуре 20–22 °C и световом режиме 12 ч свет/12 ч темнота, по 3 крысы в одной клетке. Животные CAF группы находились на кафетерийной диете в течение 6 недель, затем одну часть (n=6) подвергали эвтаназии и дальнейшему исследованию реактивности сосудов, оставшуюся часть (Post-CAF) переводили на стандартный корм еще на 6 недель до эвтаназии и миографического исследования. Исследования животных SD группы также были проведены в 2 этапа. Массу тела крыс измеряли еженедельно, с периодичностью в 2–3 недели проводили контроль кормления, на последней неделе исследуемого периода определяли биохимические показатели крови.

При использовании CAF животным предоставлялся свободный доступ как к высококалорийным продуктам, таким как печенье, чипсы, сдоба и др. [8], калорийность которых была в пределах от 350 до 550 ккал/100 г, так и к стандартному корму (Тосненский комбикормовый завод, Россия), калорийность — 250 ккал/100 г. Также животные CAF группы имели свободный доступ к 10%-ному раствору сахарозы. Применение диеты CAF осуществляли в соответствии с опубликованными рекомендациями [9]; разнообразие пищевого рациона обеспечивало включение в него 4 различных продуктов и их ежедневная замена на другие.

Оценку уровня глюкозы в крови проводили с использованием анализатора AccuCheck Active (Германия) и уровня триглицеридов (ТГ) в крови — анализатора Multicare-in (Италия) с соответствующими тест-полосками. Образцы крови получали из хвостовой вены крыс после 14-часового голодания; перед процедурой кончики хвостов анестезировали с помощью местных анестетиков лидокаина и прилокаина (крем Acriol pro, «Акрихин ХФК» АО, Россия). Для проведения глюкозотолерантного теста (ГТТ), крысам вводили внутрибрюшинно раствор глюкозы из расчета 2 г/кг массы тела, оценивали динамику изменения уровня глюкозы в крови в течение 120 мин и изменение площади под кривой (AUC) «глюкоза–время». При проведении инсулинорезистентного теста (ИРТ) применяли подкожное введение инсулина (Инсуман Рапид ГТ, Sanofi Aventis, Германия) в дозе 0,75 ЕД/кг, измеряли уровни глюкозы в крови в течение 120 мин и затем рассчитывали константу скорости утилизации глюкозы (KITT): KITT=0,693/t1/2 × 100, где t1/2 — время снижения уровня глюкозы до 50% от максимального. Во время проведения тестов уровни глюкозы в крови измеряли перед проведением теста, натощак (0) и после введения глюкозы при ГТТ, либо инсулина при ИРТ на 15, 30, 60, 90, 120 мин.

В качестве критерия оценки висцерального жира была использована масса эпидидимальных жировых подушечек, которые хорошо очерчены и легко извлекаются, что позволяет избежать весовых ошибок, возникающих при заборе всего висцерального жира. Ее определяли путем диссекции и последующего взвешивания в конце эксперимента после умерщвления животного. Эвтаназию животных осуществляли посредством декапитации, после чего иссекали грудную часть аорты для последующего миографического исследования.

Исследование изолированных сосудов с сохраненным эндотелием и периваскулярной жировой тканью проводили методом проволочной миографии, для которой кольцевые сегменты (2-3 мм) нижней трети аорты размещали в экспериментальной камере с протоком физиологическго солевого раствора (physiological salt solution; PSS) следующего состава (в мМ): NaCl — 120,4; KCl — 5,9; CaCl2 — 2,5; MgCl2 — 1,2; NaH2PO4 — 1,2; NaHCO3 — 15,5; глюкоза — 11,5. PSS сатурировали газовой смесью, состоящей из 95% О2 и 5% СО2, температуру раствора в камере поддерживали на уровне 37,5±0,1°С. Регистрацию сократительной активности сосуда проводили с помощью датчика силы FORT-25 (WPI, США). После усиления (усилитель INA333,Texas Instruments Incorporated) сигнал от датчика был оцифрован и далее обработан с помощью программы регистрации, разработанной в Институте экспериментальной медицины, обеспечивавшей непрерывную запись информации с датчика на протяжении всего эксперимента. В качестве эталона для оценки сократительной способности гладких мышц сосудов использовали гиперкалиевый раствор (60 мМ), приготовленный путем замены ионов Na+ в PSS на эквимолярное количество ионов К+, и дальнейшие сократительные ответы на введение фенилэфрина кумулятивным способом в диапазоне концентраций от 10-9 до 10-5 М выражали в % по отношению к зарегистрированному ответу на KCl. В ходе экспериментов использовали препараты: фенилэфрин (PhE, Sigma-Aldrich, США), ингибитор NO-синтазы метиловый эфир Nώ-нитро-L-аргинина — L-NAME (ICN Biomedicals; 10–4 М), экзогенный донор оксида азота (NO) — нитропруссид натрия (SNP; ICN Biomedicals; 10–5 М), блокатор калиевых каналов–тетраэтиламмония хлорид (TЭA; Sigma-Aldrich, США; 10–3 М).

Статистическая обработка данных была проведена при использовании программы GraphPad Prizm 8.0.1. Полученные в экспериментах данные были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. В соответствии с результатами этой проверки в дальнейшем были использованы соответствующие параметрические или непараметрические статистические критерии: t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна–Уитни, одно- и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) при последующем post-hoc анализе с поправкой Бонферрони. Полученные данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (SEM). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Проведение исследования одобрено биоэтической комиссией Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Использование CAF приводило к увеличению потребления корма (рис. 1А) по сравнению с SD, которой наблюдалось с первых дней ее применения. При этом стандартный корм составлял только 1/5 часть использованных продуктов (20,0±7,9%), и его потребление было ниже, чем в контрольной группе: в расчете на одну крысу 6,1±2,2 г в CAF группе vs 26,2±5,3 г в контроле. Необходимо отметить, что учет съеденного высококалорийного корма требовал тщательного отбора остатков пищи среди подстилочного материала.

Увеличение количества и калорийности использованных продуктов приводило к значительному увеличению прихода энергии (рис. 1В). Прерывание диеты и переход к стандартному питанию сопровождались снижением потребления пищи и прихода энергии (рис. 1А, В).

Изменения прихода энергии нашли отражение в изменении массы тела (рис. 2).

Учитывая, что общая масса тела и возраст (CAF vs Post-CAF) различались в исследуемых группах, выбранная для сравнения в качестве показателя степени висцерального ожирения масса эпидидимальных жировых подушечек была использована в относительных единицах (%) от величины массы тела. Этот показатель, а также показатели липидного (уровень ТГ в крови) и углеводного (уровень глюкозы в крови) обмена представлены в табл. 1 и свидетельствуют о развитии признаков метаболического синдрома при нахождении животных на CAF и улучшении состояния после ее прекращения.

Наряду с нарушениями метаболического состояния при CAF были зарегистрированы значительные изменения реактивности аорты, которые проявлялись в виде повышения сократительных ответов на применение агониста α-адренорецепторов фенилэфрина. После восстановительного периода их величина не отличалась от таковой в контрольной группе. Фенилэфрин был использован в последовательно нарастающих концентрациях от 1*10-9М до от 1*10-5М (рис. 3).

Для выявления участия NO ряд экспериментов был проведен в условиях ингибирования NO синтазы путем предварительного введения в омывающий раствор в течение 20 мин L-NAME (10-4 М). В SD и Post-CAF группах происходило усиление сократительных ответов аортальных кольцевых сегментов на введение PhE, в то время как оно практически отсутствовало в CAF группе. Дозозависимые кривые отражены на рис. 4А (в связи отсутствием статистически значимых различий в CAF и Post-CAF группах данные Post-CAF на графике не представлены). Релаксационные ответы аорты на введение экзогенного NO, полученные введением SNP (10-5 М) в PSS, не позволили выявить значимых различий во всех трех исследуемых группах (рис. 4В).

Известно, что в осуществлении релаксационных процессов гладких мышц сосудов большую роль играют калиевые каналы. В данной работе была проведена предварительная инкубация препаратов в течение 20 мин. с неселективным блокатором потенциалозависимых К+ каналов — TЭA. Его использование приводило к увеличению максимальной величины ответов на PhE у SD и Post-CAF животных и не влияло на величину ответа в CAF группе. Величина этих изменений, выраженная в процентах, представлена на рис. 4С.

Решение важной задачи снижения ССЗ и риска смерти, сопряженных с метаболическим синдромом, во многом связано с исследованиями по выяснению механизмов действия факторов, направленных на предупреждение его развития, и соответствующему изменению образа жизни. Однако остается открытым вопрос, насколько обратимыми являются нарушения, индуцированные высококалорийным питанием. В данном исследовании была использована CAF, которая зарекомендовала себя эффективной для создания модели метаболического синдрома у грызунов [9][10]. У животных CAF группы было зарегистрировано увеличение ежедневного потребления корма, а учитывая, что калорийность продуктов, составляющих CAF, превышала калорийность стандартного корма, приход энергии в диетной группе в 2,5 раза превышал таковой в контрольной группе. В высококалорийных монодиетах подобного увеличения количества потребляемой пищи не отмечается, и ряд авторов объясняют произвольную гиперфагию как инициированную вкусом пищи [11] и связывают ее с увеличением выработки дофамина [12]. Увеличение прихода энергии нашло отражение в изменении массы тела: ее возрастание было отмечено уже на 1-й неделе, а начиная со 2-й недели, животные CAF имели достоверно большую массу тела, чем в контроле. После прекращения CAF и перевода крыс на стандартную диету наблюдалось резкое снижение количества потребляемого корма и, соответственно, снижение массы тела. Особенно резко это происходило в течение 1-й недели, в дальнейшем количество потребляемого стандартного корма увеличивалось, но оставалось ниже, чем у крыс контрольной группы. Снижение массы тела было зарегистрировано только в начале Post-CAF периода, после чего отмечалось ее возрастание, однако еженедельный привес был ниже, чем в контроле, что привело к отсутствию статистически значимой разницы в массе тела у животных SD и Post-CAF групп.

В настоящее время в целом ряде исследований показана неоднозначная роль увеличения жировой ткани в метаболических нарушениях, приводящих к дисфункции органов; все чаще используются понятия метаболически «здоровое» и «нездоровое» ожирение [13]. Последнее связывают с избыточным накоплением висцеральной жировой ткани. В данной работе, где в качестве показателя степени висцерального ожирения была использована масса эпидидимальной жировой ткани, было зарегистрировано значительное увеличение ее процентного отношения к массе животного в CAF группе по сравнению с SD и практически возвращение к норме за время Post-CAF периода. Одновременно происходило восстановление метаболических показателей — уровней глюкозы и триглицеридов в крови, инсулинорезистентности, повышенных при CAF. Эти результаты согласуются с данными исследований, где нормализацию веса, содержания висцерального жира и метаболических показателей наблюдали уже через 4 недели после прекращения диеты [5].

Значимым является вопрос о функциональных изменениях кровеносных сосудов, в частности сосудистого тонуса, сопряженных с развитием МС. В настоящее время пересмотрен взгляд на жировую ткань (ЖТ) как на относительно инертную, функция которой сводится главным образом к образованию энергетического депо организма. ЖТ опосредованно через адипокины, а в случае ПВЖТ и через другие вещества, вырабатываемые клетками стромального матрикса [14], регулирует сосудистый тонус. При ожирении эта регуляция нарушается в сторону преобладания вазоконстрикции. После 6 недель применения CAF у животных были зарегистрированы значительные изменения сократительной деятельности аорты при активации адренорецепторных структур PhE. Сократительные ответы на его действие возрастали, а эксперименты с использованием ингибитора eNOS свидетельствовали о вовлечении NO в релаксационные процессы в контрольной группе и частичной потере этой способности при использовании диеты. Причем потери чувствительности сосудистых гладких мышц к NO не происходило, т.к. величина релаксации на введение экзогенного NO не изменялась. Одним из важных путей реализации релаксационных процессов, препятствующих вазоконстрикции, является изменение проводимости калиевых каналов, приводящее к развитию гиперполяризации гладкомышечных клеток сосудов. Эти клетки экспрессируют множество изоформ, по меньшей мере пяти классов К+-каналов, которые способствуют регуляции сокращения и пролиферации клеток [15][16]. Отмечена также региональная гетерогенность их присутствия в различных типах сосудов [15], хотя их функциональный вклад в изменение сосудистой реактивности при патологических состояниях в различных исследованиях носит весьма противоречивый характер. В данной работе мы использовали неспецифический блокатор потенциалзависимых К+-каналовканалов TЭA, который также эффективно блокирует Са2+-активируемые К+-каналы большой проводимости (ВКСа). В аортальных кольцах крыс SD инкубация с ТЭА приводила к значительному увеличению величины сократительных ответов на действие PhE, что согласуется с данными о значении этих каналов, полученными, в частности, в иризин-индуцированной вазодилатации грудной аорты [16]. Однако в аортальных препаратах CAF группы этого не происходило, что говорит о снижении участия данного механизма, препятствующего усиленной вазоконстрикции, при метаболических изменениях, происходящих при использовании CAF. Результаты миографического исследования после окончания Post-CAF периода свидетельствуют о восстановлении как NO-зависимого пути, так и механизма, опосредуемого через активацию калиевых каналов. Это, в свою очередь, приводит к снижению повышенной вазоконстрикции, наблюдаемой при CAF.

Остается актуальным вопрос о механизмах дисфункциональных изменений сосудов, происходящих при длительном высококалорийном питании. Ранее нами было показано, что важная роль в их возникновении принадлежит периваскулярной жировой ткани (ПВЖТ), окружающей аорту, антисократительные свойства которой снижаются при использовании CAF [8]. Дальнейшие исследования взаимосвязи обратимости функциональных нарушений, вызванных диетой, продемонстрированной в данной работе, и состояния ПВЖТ могут дать ключ к пониманию механизмов восстановления сократительной активности сосудов. В литературе имеются данные о том, что у крыс и мышей, находящихся на диетах с высоким содержанием жиров и сахаров, функциональное состояние сосудов и ПВЖТ улучшается при физических нагрузках [17][18]. Это улучшение было зарегистрировано на 6–10 неделях после начала физических нагрузок при продолжающейся высококалорийной диете. В нашем исследовании отказ от использования диеты и переход на стандартный корм уже после 6-й недели приводил к нормализации метаболических показателей и реактивности аорты. Учитывая, что было продемонстрировано [5][19] возвращение к контрольному уровню метаболических показателей и продукции некоторых вазоактивных факторов ЖТ уже после 4 нед. прекращения диеты, необходимы исследования возможности восстановления реактивности сосудов на более ранних сроках и с учетом регионарных особенностей.

В данной работе продемонстрировано, что высококалорийная диета кафетерия, включающая ультрапереработанные продукты с повышенным содержанием жиров и углеводов, является удобной и адекватной моделью для развития метаболического синдрома у крыс. Через 6 недель ее применения у животных были зарегистрированы висцеральное ожирение, гипергликемия и нарушение толерантности к глюкозе, повышенные уровни тригицеридов в плазме крови. Возврат к нормальному питанию сбалансированным стандартным кормом устранял отмеченные нарушения липидного и углеводного обмена.

В ходе проведенного миографического исследования аорты установлено, что использование диеты кафетерия приводит к усилению вазоконстрикторных ответов на действие фенилэфрина вследствие снижения антисократительного влияния NO и эффективности транспорта ионов калия по потенциалозависимым и/или Са2+-активируемым К+-каналам гладких мышц. После 6-недельного постдиетного периода происходит восстановление сократительной деятельности сосудов, параметры которой статистически не отличались от регистрируемых в норме. Полученные данные свидетельствуют об обратимости исследованных патологических процессов, возникающих при использовании диеты кафетерия, после нормализации питания.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке госпрограммы 47 ГП «Научно-технологическое развитие Российской Федерации» (2019–2030), тема 0134-2019-0001.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.