Влияние экзогенного мелатонина на оксидативный статус и состояние перекисного окисления белков у крыс с моделью алиментарного ожирения

Обоснование

По данным ВОЗ, в 2014 г. в мире насчитывалось около 1,9 млрд людей, имеющих избыточный вес. В России избыток массы тела имеется у 60% женщин и 50% мужчин старше 30 лет, а 30% населения страдают ожирением. Ожирение приводит к снижению и даже к утрате работоспособности, частой госпитализации данной группы населения из-за развития клинических осложнений (сахарный диабет 2 типа, артериальная гипертензия, сердечная недостаточность и др.) [1]. Накопившиеся знания о процессах метаболизма различных питательных веществ при ожирении говорят о полиэтиологической и полипатогенетической природе их нарушений. Немаловажная роль при этом отводится процессам свободнорадикального окисления.

Многочисленными работами было показано, что ожирение сопровождается оксидативным стрессом, характеризующимся нарушением равновесия в системе прооксиданты-антиоксиданты в сторону активации свободнорадикального перекисного окисления, которое приводит к повреждению биологических мембран клеток и внутриклеточных органелл, определяющих их морфологическую целостность, рецепцию, ионную проницаемость и транспорт метаболитов [2].

Действию активных форм кислорода (АФК) подвергаются не только липиды, но и белки [3, 4]. У белков фрагментируются их молекулы, изменяется нативная конформация с образованием крупных агрегатов, что приводит к инактивации ферментов, а это, в свою очередь, нарушает метаболизм и функционирование клеток [5]. Имеются исследования, подтверждающие, что при ряде форм патологии вначале именно белки подвергаются окислительной модификации [6, 7]. Продукты перекисного окисления белков (ПОБ) имеют длительный период распада и большую стабильность по сравнению с продуктами перекисного окисления липидов (ПОЛ), что и делает их надежным показателем активации свободнорадикального окисления [8–11].

В настоящее время проводятся научные работы по поиску веществ, в том числе и антиоксидантов, ослабляющих образование как продуктов ПОЛ, так и продуктов ПОБ [12]. Для этих целей нами был использован препарат мелатонина Мелаксен. Мелатонин, как общеизвестно, является основным вырабатываемым эпифизом гормоном, образование которого подвержено суточной периодичности с максимальной выработкой в темное время суток (с 21:00 до 7:30 у человека и с 13:00 до 18:00 у крыс) [13]. Основная функция данного гормона − модулирующее влияние на циркадную организацию физиологических процессов и обеспечение синхронизации биологических ритмов организма с ритмами окружающей среды. В частности, имеются данные о наличии у мелатонина антиоксидантного действия, заключающегося в связывании свободных радикалов, усилении активности антиоксидантных ферментов и потенцировании действия других эндогенных антиоксидантов [14, 15].

Цель

Оценить действие экзогенного мелатонина на оксидативный статус и состояние ОМБ у крыс с моделью алиментарного ожирения.

Методы

Исследование проводилось на 27 белых крысах – самцах линии Wistar массой тела 160–180 г. Животные были разделены на 3 серии по 9 особей в каждой: 1-я серия – интактные животные; 2-я серия – животные с алиментарным ожирением без введения мелатонина; 3-я серия – животные с алиментарным ожирением с введением мелатонина. Все исследуемые крысы находились в виварии в течение 2,5 мес.

Алиментарное ожирение (2-я и 3-я серии) воспроизводилось путем скармливания животным в течение 7 нед высококалорийной углеводно-жировой пищи, состоящей из лабораторного корма «Ассортимент Агро» (42,5%), сливочного масла (25%) и сладкого сгущенного молока (32,5%) [16]. Диета содержала белки – 9,28%, жиры – 25,52%, углеводы – 20,1%. На каждую особь в сутки приходилось по 40 г такой пищи. Животные без ожирения получали 40 г лабораторного корма «Ассортимент Агро», содержащего 9,2% белков, 2% жиров, 4,4% углеводов. Препарат мелатонина Мелаксен вводили через 5 нед с начала моделирования ожирения животным 3-й серии ежедневно в течение 12 дней орально в дозе 2 мг/кг массы тела с помощью металлического зонда 1 раз в день в период между 13:00 и 18:00 ч. Препарат предварительно растворяли в эквивалентном количестве 0,9% раствора хлорида натрия с образованием суспензии. Животным 2-й серии через 5 нед с начала моделирования ожирения ежедневно на протяжении 12 дней перорально вводили 0,9% раствор хлорида натрия. Во время моделирования ожирения у животных еженедельно регистрировали изменение массы тела (на электронных весах) в момент введения препарата в исходном состоянии и через 12 дней его ежедневного применения.

В начале и конце эксперимента (после забора крови для определения биохимических показателей) определяли максимальную физическую работоспособность крыс (плавательная проба до третьего погружения животного под воду) и их устойчивость к тяжелой гипобарической гипоксической гипоксии (до момента возникновения клонических судорог). Максимальная физическая работоспособность определялась по продолжительности плавания крыс с грузом у корня хвоста (5% от массы тела) в резервуаре большого объема, заполненного водой с температурой 21°С. Устойчивость животных к гипобарической гипоксической гипоксии определялась с помощью аппарата Комовского.

ОМБ определялась методом R. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [17]. Метод основан на взаимодействии окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием динитрофенилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях спектра.

Кроме того, определяли маркер ПОЛ-ТБК (тиобарбитуровой кислоты)-реактивные продукты. Данный метод определения основан на реакции малонового диальдегида (МДА) с ТБК с образованием триметилового комплекса, придающего раствору розовое окрашивание [18].

Этическая экспертиза

Все работы с подопытными животными проводились в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказом Министерства здравоохранения РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Статистический анализ

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statsoft Stаtistica 6.0. Соответствие выборок нормальному распределению проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Так как распределение величин показателей соответствовало нормальному, для определения статистической значимости в независимых группах использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и критерий Ньюмена-Кейлса, а в зависимых группах – ANOVA повторных измерений и критерий Ньюмена-Кейлса повторных измерений. Статистически значимыми считали отличия при р≤0,05 [19].

Результаты

При потреблении крысами 2-й и 3-й серии высококалорийной пищи было установлено значительное увеличение их массы тела (более 20% от первоначальной) (рис. 1; ***1–2 р=0,009; ***1–3 р=0,009). Прирост массы тела у крыс 2-й и 3-й серий по сравнению с исходной величиной был статистически значимым со 2-й недели потребления высококалорийного корма (рис. 1; *2 p=0,039; **3 р=0,048). У крыс 1-й серии наблюдалась постепенная прибавка массы тела, что объясняется ростом и взрослением крыс, а также благоприятными условиями их содержания в виварии. Данная тенденция наблюдалась и в наших предыдущих работах [20]. При вскрытии животных была выявлена значительная разница в общем количестве внутрибрюшного и подкожного жира между интактной серией и сериями с ожирением (*1–2 p=0,008; **1–3 р=0,009) (рис. 2).

Рис. 1. Динамика изменений массы тела у крыс 1–3 серий

Рис. 2. Количество жира у крыс трех серий

Проведенные нами тесты, отражающие физическую работоспособность и гипоксическую выносливость подопытных крыс (рис. 3 и 4), показали значительное снижение выносливости крыс с алиментарным ожирением в сериях 2 и 3, по сравнению с животными 1-й серии (рис. 3; *1–2 p=0,049; **1–3 p=0,048; рис. 4 *р=0,047; **р=0,009). Это, очевидно, связано с повышением внутрибрюшного и внутригрудного давления в связи с избыточным отложением жира в брюшной полости и высоким стоянием диафрагмы, что затрудняет работу сердца и уменьшает дыхательную экскурсию грудной клетки, а также снижает эластичность самой легочной ткани, что приводит к снижению вентиляции легких, нарушению их газообмена, а в итоге к – дыхательной недостаточности [21].

Рис. 3. Динамика изменения устойчивости крыс всех серий к гипобарической гипоксической гипоксии

Рис. 4. Динамика изменения продолжительности плавательной пробы крыс всех серий

У крыс с алиментарным ожирением (серии 2 и 3) отмечалось значительное увеличение концентрации ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови по сравнению с исходными данными как внутри этих серий (*p=0,008), так и по отношению к интактной серии (рис. 5; **1–2 p=0,047; **1–3 р=0,048). Введение препарата мелатонина у крыс 3-й серии привело к значительному снижению концентрации в крови ТБК-реактивных продуктов (рис. 5; *р=0,009; **2–3 р=0,006), что коррелирует с полученными ранее результатами других исследователей [22].

Рис. 5. Изменение концентрации ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови у крыс 1–3 серий

При потреблении высококалорийной углеводно-жировой пищи у крыс 2-й и 3-й серий отмечалось увеличение активности процессов ОМБ, что проявлялось статистически значимым увеличением общего количества карбонильных производных белков по сравнению с интактной серией (рис. 6; *1–2 р=0,049; *1–3 р=0,047). Увеличение площадей альдегиддинитрофенилгидразонов (АДНФГ)и кетондинитрофенилгидразонов (КДНФГ) ультрафиолетового (УФ) спектра характеризует степень повреждения аминокислотных остатков нейтрального характера. Увеличение площадей АДНФГ и КДНФГ видимого спектра аналогичным образом приводит к повреждению аминокислотных остатков основного характера [23]. Таким образом, ОМБ при алиментарном ожирении, моделируемом потреблением высококалорийной углеводно-жировой пищи, у крыс 2-й и 3-й серий осуществляется неспецифично, о чем говорят сравниваемые показатели ОМБ между сериями подопытных крыс (рис. 7). Кроме того, нами отмечено, что доля суммарного количества АДНФГ, являющихся первичными маркерами оксидативного стресса, относительно общего содержания карбонильных производных составляет более 80%. Их накопление указывает на процесс фрагментации белков [24].

Рис. 6. Общее количество карбонильных производных белков

Рис. 7. Доля суммарного количества АДНФГ и КДНФГ- относительно общего содержания карбонильных производных белков

После введения суспензии мелатонина в дозе 2 мг/кг изменения уровня карбонильных производных не наблюдалось (рис. 6). По-видимому, данный результат объясняется необходимостью использования большей концентрации препарата и/или увеличения периода его экспозиции, что требует дальнейшего изучения.

Обсуждение

Резюмируя полученные данные, следует отметить, что скармливание животным высококалорийного углеводно-жирового корма приводит к достаточно быстрому развитию ожирения у крыс, что обусловливает снижение физической работоспособности и устойчивости к тяжелой гипобарической гипоксической гипоксии вследствие изменения высоты стояния диафрагмы, уменьшения объема грудной полости, дистрофии скелетных мышц, в том числе и дыхательных. Неразрывно с увеличением массы тела и накоплением висцерального жира активизируются процессы свободнорадикального окисления, затрагивающие не только нарушение липидных структур, но и белков, причем повреждение аминокислот в их составе происходит неселективно. В качестве индукторов образования ОМБ могут выступать АФК (ОН˙, О2˙-, Н2О2, О2), активные формы азота (NO˙-, ONOO-], металлы переменной валентности (Сu2+, Fe2+), продукты ПОЛ (ТБК-реактивные продукты (МДА), 4-гидрокси-2-ноненаль (ГНЕ)) [25]. МДА и ГНЕ являются наиболее распространенными продуктами взаимодействия липидов с АФК. МДА имеет в своей структуре две альдегидные группы, что обуславливает его взаимодействие с аминогруппами белков. ГНЕ может взаимодействовать с гистидином, лизином и цистеином, образуя циклические продукты, способные далее превращаться в карбонильные группы [26]. Влияние мелатонина на данные процессы реализуется несколькими механизмами. Свои цитопротективные свойства мелатонин реализует посредством как прямой способности связывать АФК вследствие образования различных биологически активных соединений, таких как N-ацетилсеротонин, 5-метокситриптамин, N-диметил-5-метокситриптамин, 5-метокситрифотол, циклический 2-гидроксимелатонин, пинолин и 5-метоксилированные кинурамины [27], так и посредством воздействия на мембранные и ядерные рецепторы, опосредованно влияющие на экспрессию генов ферментов антиоксидантной защиты [28]. Нами показано, что снижение ТБК-реактивных продуктов (в том числе МДА) не сопровождалось ослаблением процессов ОМБ, как ожидалось нами, что подтверждает наличие других инициаторов ОМБ при алиментарном ожирении. Также стоит отметить, что изменений в функциональной активности крыс после применения исследуемого препарата не наблюдалось, что говорит о низких в данной концентрации адаптивных возможностях мелатонина. Не специ фич ный процесс ОМБ при алиментарном ожирении указывает на то, что окислительный стресс затрагивает большинство структур белков, инактивируя их. Но не совсем отчетливые результаты оценки влияния мелатонина на ОМБ, в отличие от положительного – параллельного эффекта на ПОЛ, возможно, связаны с необходимостью использования большей концентрации исследуемого препарата и/или увеличения периода его экспозиции.

Заключение

В последнее время изучение биохимической и физиологической активности гормона шишковидной железы − мелатонина интересует исследователей различных стран мира, что обусловлено достаточно широким спектром его биологических эффектов: выполнение роли антиоксиданта, регулятора функций всех без исключения клеток [29, 30] и т.д. Между тем изучение свойств мелатонина позволяет указать на несколько вероятных причин разноречивости результатов исследований его различных видов активности. К ним, в частности, могут относиться: видовые особенности экспериментальных животных, исходное функциональное состояние исследуемого организма, доза и способ введения мелатонина, возрастные различия [31, 32] и др. Особенно высок его антиоксидантный потенциал, который может быть использован в клинической практике, в том числе при алиментарном ожирении и ассоциированных с ним видах патологии. Однако вопросы изучения процессов и механизмов ОМБ при разных формах патологии остаются открытыми. Нами была показана важная роль гиперкалорийной пищи в развитии как алиментарного ожирения, так и изменении оксидативного статуса организма в сторону активации свободнорадикальных процессов, затрагивающих различные его структуры, в частности, приводящих к повреждению белковых молекул. Одновременно нами отмечено, что состояние белковых структур при ожирении более стабильное, а их повреждение неспецифичное и устойчивое к антиоксидантному воздействию мелатонина. Это свидетельствует о высокой актуальности и необходимости дальнейшего изучения этого важного медико-биологического процесса.

Дополнительная информация

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.