Изучение связи между полиморфизмом rs4920566 гена рецептора сладкого вкуса (TAS1R2), чувствительностью к сахарам и пищевым предпочтением сладких продуктов

ОБОСНОВАНИЕ

Способность человека ощущать сладкий вкус связана с потреблением энергии, выбором продуктов и получением удовольствия от еды [1][2]. Сахара вызывают у человека приятное вкусовое ощущение, но люди по-разному воспринимают интенсивность сладости. По сравнению с горькими, кислыми и солеными веществами высокие концентрации сахара в пище не стимулируют чувство отвращения. Разбалансированное питание из-за повышенного употребления высококалорийной сладкой пищи может стать причиной избыточной массы тела и вести к развитию серьезных болезней, таких как ожирение, сахарный диабет и рак [3][4]. В связи с этим особое внимание сконцентрировано на персонализированном подходе к коррекции питания на основе генетического тестирования, при этом список полиморфных локусов постоянно расширяется.

Распознавание сладких веществ у грызунов и человека осуществляется белками-рецепторами T1R, ассоциированными с G-белками [5]. Исследования на клеточной линии HEK-293 показали, что белки T1R2 и T1R3 образуют гетеродимерный рецептор, распознающий все природные сахара, сахарозаменители, сладкие пептиды и некоторые аминокислоты [6]. Причем в рецепторе белок T1R2 отвечает за восприятие всех сладких стимулов, тогда как белок T1R3 служит дополнительным низкоаффинным сенсором сахаров [7].

Установлено, что у человека белки T1R кодируются семейством генов TAS1R, локализованных на хромосоме 1p36 в следующем порядке: TAS1R2–TAS1R1–TAS1R3. Ген TAS1R2 наиболее полиморфен по сравнению с двумя остальными. Его вариабельность может влиять на чувствительность людей к сладким стимулам [8]. Ранее выявлены ассоциации отдельных полиморфных локусов TAS1R2 с потреблением углеводов и чувствительностью к сахарам у людей с разным индексом массы тела [9] и повышенным содержанием триглицеридов в сыворотке крови [10].

Однако генетические предпосылки вкусовой чувствительности людей к сладким стимулам остаются недостаточно изученными. Однонуклеотидная замена (ОНЗ) g.18853330 A>G в интроне гена TAS1R2 расположена в метилированной области и потенциально может вносить вклад в изменение сайта связывания с фактором транскрипции и, соответственно, в экспрессию гена [11]. Хотя ранее rs4920566 полиморфизм TAS1R2 не был связан с потреблением сахара и нарушением обмена у людей [9][12], его роль в предпочтении к сладкому до конца не изучена, проведены единичные исследования. Кроме того, по данным литературы, мужчины и женщины по-разному реагируют на вкусовые стимулы и отличаются пищевым поведением к сладостям [13]. Механизмы генетического контроля вкусовых реакций на сладкое у мужчин и женщин также остаются малопонятными.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить возможную связь полиморфизма rs4920566 гена TAS1R2 (g.18853330 A>G) с чувствительностью людей к природным сахарам и пищевым предпочтением высококалорийных сладких продуктов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Работа выполнена на базе лаборатории иммуногенетики ФИЦ Угля и Углехимии СО РАН (Институт экологии человека СО РАН) и кафедры бионанотехнологии Кемеровского государственного университета (КемГУ).

Время исследования. Исследование начато в марте 2019 г. и закончено в апреле 2021 г., электронная база собранного материала составлена в мае 2021.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Изучалась одна популяция: студенты-добровольцы, обучающиеся в КемГУ и Кемеровском государственном медицинском университете, г. Кемерово.

Критерии включения: пол (мужской, женский), возраст (от 17 до 23 лет).

Критерии исключения: не применялись.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

Выборка формировалась произвольным способом.

Дизайн исследования

Одноцентровое одновыборочное сравнительное экспериментальное исследование.

Описание медицинского вмешательства (для интервенционных исследований)

Исследование состояло из двух дегустационных тестов, проводимых в разное время, и анкетирования. Перед началом каждого дегустационного теста и между испытаниями всем участникам было предложено прополоскать рот дистиллированной водой. Тестирование дегустационных растворов сахаров проводили спустя 2 ч после приема пищи. Студентам было предложено воздержаться от курения и жевательной резинки за 2 ч до тестирования. Все растворы сахаров готовили не позднее чем за24 ч до начала тестирования и хранили при температуре +4°С. Во время тестирования все растворы были комнатной температуры.

Оценка различия вкуса натуральных сахаров. В тесте участвовал 41 студент. Способность людей различать вкус четырех натуральных сахаров (мальтозы, глюкозы, сахарозы и фруктозы) оценивали исходя из степени их сладости. Для этого использовали водные растворы сахарозы (ООО «Регион Трейд», г. Новосибирск), глюкозы (ООО «Развитие», г. Санкт-Петербург), фруктозы («HCBEER», г. Москва) и мальтозы (ЗАО «ДИАДАР», г. Москва) с исходной концентрацией 1 M/л. Растворы сахаров объемом 20 мл были распределены в одноразовые пластиковые стаканчики с трехзначным кодом. Порядок предоставления стаканчиков был случайным. После дегустации участникам предлагалось расставить их в последовательности увеличения сладости раствора.

Оценка порога чувствительности сладкого вкуса. В тесте приняли участие 79 студентов. Порог чувствительности (ПЧ) к сладкому вкусу оценивали с помощью ступенчатой методики, приведенной в работе [9]. Использовался водный раствор сахарозы с расширенным разведением от 8,0 до 500 мМ/л. Первоначальная концентрация раствора сахарозы, предоставляемого каждому участнику исследования, составила 31,0 мМ/л (10,6 г/л). Растворы сахарозы и дистиллированной воды объемом 20 мл были распределены в одноразовые пластиковые стаканчики, помеченные трехзначным кодом. Каждому участнику предоставлялся один стаканчик с раствором сахарозы и два стаканчика с водой, нейтральной по вкусу и запаху. Порядок предоставления стаканчиков был случайным. Если участник уверенно различал сладкий вкус раствора, то следующую концентрацию раствора сахарозы понижали. В случае сомнения, напротив, концентрацию сахарозы повышали. Пауза между испытаниями составляла не менее 10 мин. Все испытуемые студенты были проинформированы, что угадывание неприемлемо, если вкус содержимого трех стаканчиков не различался.

Оценка пищевого предпочтения сладких продуктов. 136 студентам было предложено заполнить анкету с вопросами о пищевом предпочтении девяти категорий продуктов, имеющих сладкий вкус. Каждый вопрос анкеты оценивался по десятибалльной шкале: «очень нравится» (10 баллов) и «совсем не нравится» (1 балл). Все продукты и напитки были известны участникам. Рейтинг симпатий продуктов использовался в качестве количественных переменных для статистического анализа.

Материалом для исследования послужили клетки буккального эпителия, которые хранили при температуре -20°C.

Протокол исследования включал заполнение карт с анамнестическими данными (пол, возраст, национальная принадлежность, хронические заболевания, курение) и внесение результатов дегустационных тестов, анкетирования и генотипирования полиморфизма rs4920566 TAS1R2.

Методы

Выделение геномной ДНК из клеток буккального эпителия осуществляли с помощью метода адсорбции ДНК с неорганическим сорбентом (боросиликатное стекло) в присутствии хаотропного агента — гуанидина тиоцианата (Gu). В пробирку с буккальными клетками добавляли 250 мкл лизирующего буфера (6 M Gu-HCl, 40 мМ Трис-HCl (рН 7–8), 36мМ ЭДТА), прогревали при температуре 65°C 5 мин, а затем вносили 20 мкл сорбента. Осадок дважды отмывали буфером (55% этанол, 10 мМ Трис-HCl (рН 7–8), 100 мМ NaCl) и однократно 70% этанолом (400 мкл). Подсушивали 10 мин при температуре 56°C. Затем вносили 100 мкл буфера для элюции (10 мМ Трис-HCl (рН 7–8), 0,5 мМ ЭДТА) и прогревали 10 мин при температуре 56°C. Суспензию осаждали центрифугированием при 13 000 об/мин в течение 2 мин. Супернатант, содержащий 20–100 нг ДНК, отбирали и хранили при -20°C.

Типирование ОНЗ в гене TAS1R2 (g.18853330 A>G, rs4920566) осуществляли с помощью метода асимметричной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда и последующим анализом кривых плавления. Реакцию амплификации проводили в термоциклере CFX96 (Bio Rad, США) при следующих условиях: начальная денатурация (96°С — 3 мин); затем 54 цикла, включающих денатурацию при 96°С, — 6 с, отжиг праймеров при 56°С — 6 с и последующую элонгацию при 72°С — 6 с; регистрировали кривые плавления в диапазоне температур 35–85°С, повышая температуру на 0,5°С в каждом цикле от начальной температуры, каждый шаг сопровождался регистрацией флуоресцентного сигнала в диапазоне длин волн, соответствующем интервалу эмиссии флуорофора. Общий объем реакционной смеси составил 20 мкл: 10 мМ Трис-HCl (рН 8,9), 55 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl₂, 0,05% Tween 20; 0,2 мМ dNTP; 20–100 нг ДНК; 1 ед. акт. Klentaq-ДНК-полимеразы; растворы олигонуклеотидных праймеров и зонда в следующих концентрациях: лимитирующий — 0,1 мМ (5’-gaattgtggtgccagttg-3’), избыточный — 1 мМ (5’-aagaggagtaaagcacccat-3’), зонд — 0,1 мМ (5’-R6G-ACTGCGTATTGCTGTATGTCC-BHQ-3’).

Статистический анализ

Этическая экспертиза

Все участники дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ИЭЧ СО РАН (протокол №57 от 05.03.2019 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

Основные результаты исследования

Типирование ОНЗ гена TAS1R2 g.18853330 A>G (rs4920566) показало, что наблюдаемые частоты генотипов rs4920566 TAS1R2 были сопоставимыми с ожидаемыми частотами в соответствии с законом Харди–Вайнберга (p=0,37, данные не показаны).

Оценка порога чувствительности сладкого вкуса.

Вкусовую чувствительность студентов к сахарам оценивали в двух дегустационных тестах, где определяли способность различать вкус четырех природных сахаров и пороговую чувствительность к сладкому вкусу. Сахара обладают неодинаковой сладостью [14]. Согласно шкале интенсивности сладости разных сахаров, верным было следующее расположение растворов относительно сахарозы: мальтоза → глюкоза → сахароза → фруктоза. Большинство студентов (83%) ощутили разницу во вкусе дегустируемых растворов сахаров и верно расположили их в порядке увеличения сладости, 17% студентов не смогли различить вкус. Как выяснилось, юноши чаще, чем девушки, не могли различить вкус четырех растворов сахаров (72% против 28%) (рис. 1).

Логистический регрессионный анализ показал, что пол студентов был значимым фактором, влияющим на восприятие вкуса сладости сахаров (β=-2,93 (0,99); p=0,003). Распределение частот генотипов rs4920566 гена TAS1R2 в подгруппах студентов, отличивших и не отличивших вкус четырех сахаров, было равновероятным (данные не показаны, p=0,631, аддитивная модель), в том числе с учетом поправки на пол (p=0,337).

Обнаружено, что отдельно факторы полиморфизма rs4920566 гена TAS1R2 и пол значимо не влияли на ПЧ к сахарозе у студентов (табл. 1).

В то же время оказалось, что оба фактора могут взаимодействовать друг с другом. Сопоставление значений медиан ПЧ к сладкому вкусу при одном и том же генотипе TAS1R2 у юношей и девушек выявило статистически значимую связь только для генотипа A/G (16,0 [ 16,0–31,0] против 16,0 [ 8,0–16,0] ммоль/л; p_cor=0,010), но не для генотипов A/A и G/G. Несмотря на одинаковые медианы ПЧ к сладкому вкусу у юношей и девушек с генотипом A/G, диапазон ПЧ у девушек был сдвинут в сторону более низких концентраций сахарозы и соответствовал высокой чувствительности к сладкому вкусу, чем у юношей (табл. 1). Такая же картина наблюдалась в случае носительства аллеля A rs4920566 гена TAS1R2 (генотипы A/A+A/G). Обнаружено, что вариационный ряд значений ПЧ к сахарозе у девушек с аллелем A был значимо более низким по сравнению с юношами (16,0 [ 16,0–31,0] против 16,0 [ 8,0–16,0] ммоль/л; p_cor=0,002). Вариационные ряды ПЧ к сладкому вкусу у юношей и девушек — носителей аллеля G (генотипы G/G+A/G) TAS1R2 значимо не отличались (p=0,263).

Сравнение вариационных рядов значений ПЧ к сахарозе в зависимости от генотипа гена TAS1R2 отдельно в подгруппах юношей и девушек не выявило каких-либо значимых различий между ними, за исключением генотипа G/G TAS1R2 в подгруппе девушек (табл. 1). Оказалось, что у девушек с генотипом G/G TAS1R2 диапазон ПЧ к сладкому вкусу сдвинут в сторону более высоких концентраций сахарозы по сравнению с девушками с генотипом A/G (16,0 [ 16,0–31,0] против 16,0 [ 8,0–16,0] ммоль/л; p_cor=0,039) и связан с низкой чувствительностью к сладкому вкусу.

Оценка пищевого предпочтения сладких продуктов. Поскольку полиморфизм гена TAS1R2 rs4920566 связан с чувствительностью студентов к сладкому вкусу, предположили, что он может влиять на пищевое предпочтение продуктов со сладким вкусом. С помощью теста Краскела–Уоллиса проверяли гипотезу о случайности связи между генотипами rs4920566 гена TAS1R2 и рейтингом симпатий категорий продуктов со сладким вкусом. Различия между группами считали значимыми, если после введения поправки на множественность сравнений значение p было ≤0,002. Данные представлены в таблице 2.

Как выяснилось, ОНЗ rs4920566 гена TAS1R2 не связана с выбором сладостей у студентов. Экспериментально рассчитанные значения уровня статистической значимости критерия Краскела–Уоллиса для рейтинга симпатий разных категорий сладких продуктов соответствовали неравенству p≥0,002. Полученные результаты не позволили отвергнуть нулевую гипотезу и сделать вывод о том, что рейтинг симпатий для сладких продуктов может отличаться у студентов с генотипами A/A, A/G иG/G гена TAS1R2 (табл. 2). Подобные результаты были получены и в подгруппах юношей и девушек (данные не показаны).

ОБСУЖДЕНИЕ

Репрезентативность выборок

Распределение частот генотипов rs4920566 гена TAS1R2 значительно варьирует у людей разных этносов (табл. 3).

Мы сопоставили собственные результаты с результатами других исследований (данные литературы и проекта «1000 Геномов»). Обнаружены значимые отличия (p<0,05) в частотах встречаемости генотипов rs4920566 гена TAS1R2 у обследуемых нами студентов и представителей отдельных этнических групп. Как оказалось, в пределах популяций, имеющих европейское происхождение, наблюдаются вариации в частотах аллелей и генотипов rs4920566 TAS1R2. Возможно, есть неучтенные особенности при формировании выборок, влияющие на их распределение.

Сопоставление с другими публикациями

Наше исследование показало, что полиморфизм rs4920566 гена TAS1R2 не влиял на чувствительность к сладости четырех растворов сахаров у студентов, тогда как половой фактор являлся значимым при оценке сладости. Девушки лучше чувствовали разницу во вкусе четырех сахаров и правильно идентифицировали дегустируемые растворы, в то время как юноши чаще ошибались в оценке сладости.

По данным литературы, женщины лучше идентифицируют сладкие растворы и чаще являются «супердегустаторами» по сравнению с мужчинами [13]. Поэтому предположили, что оба фактора, пол и rs4920566 полиморфизм гена TAS1R2, могут влиять на ПЧ к сладкому вкусу у студентов.

Аллель A (p=0,002) и генотип A/G (p=0,010) TAS1R2 были связаны с разным диапазоном ПЧ к сахарозе у юношей и девушек. Девушки с аллелем A и генотипом A/G TAS1R2 имели более низкий вариационный ряд ПЧ к сахарозе и, соответственно, более высокую чувствительность к сладкому вкусу по сравнению с юношами. Ассоциация генотипа A/G TAS1R2 с повышенной чувствительностью к сладкому вкусу у девушек может объясняться небольшим количеством обследуемых студентов, в результате чего ассоциации гомозиготных генотипов A/A и G/G не достигали статистической значимости (p=0,066). В то же время отдельно в подгруппе девушек генотип G/G был ассоциирован с высоким диапазоном ПЧ к сахарозе и, соответственно, с низкой чувствительностью к сладкому вкусу.

Вкусовая чувствительность играет важную роль в пищевых привычках и энергетическом балансе организма. Предполагается, что люди с искаженной или пониженной вкусовой чувствительностью чаще предпочитают продукты, вызывающие большую стимуляцию вкуса и соматосенсорной системы, что ведет к неправильному питанию и, как следствие, метаболическому синдрому [20]. Можно было ожидать, что девушки с генотипом G/G TAS1R2 являются «сладкоежками» и чаще могут отдавать предпочтение сладким продуктам, чем девушки с генотипами A/A и A/G. Поэтому мы не исключили вероятность связи ОНЗ rs4920566 гена TAS1R2 с выбором сладких продуктов. Как выяснилось, связь ОНЗ rs4920566 гена TAS1R2 с выбором девяти категорий сладких продуктов у обследуемых лиц отсутствовала. По-видимому, этот полиморфизм гена TAS1R2 не вносит какого-либо эффекта в стимуляцию вкуса сладкой пищи у людей. Вероятно, ОНЗ rs4920566 гена TAS1R2 не является информативной для оценки пищевых предпочтений сладких продуктов у людей. Наше предположение согласуется с данными литературы. В литературе отсутствует связь между ОНЗ rs4920566 TAS1R2, употреблением сладкой пищи и развитием болезни (избыточный вес [9][11], сахарный диабет II типа [12], кариес [16][21]). В то же время корреляции ОНЗ rs4920566 TAS1R2 с чувствительностью к сладкому вкусу у девушек и с чувствительностью людей к вкусу низкокалорийного подсластителя ребаудиозида А (стевии) и симпатии к продуктам с содержанием стевии [17] дают основание полагать, что эта ОНЗ может быть связана с механизмами нейротрансдукции сладкого вкусового сигнала.

Ограничения исследования

Ограничением нашего исследования было небольшое количество юношей, поскольку по сравнению с девушками юноши менее озабочены вопросами своей фигуры и неохотно откликались на участие в исследовании. Кроме того, не была учтена связь полиморфизма rs4920566 TAS1R2 с чувствительностью людей к другим сладким стимулам (аминокислотам, подсластителям), в том числе при патологии, поэтому требуется продолжение исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пол студентов, но не полиморфизм rs4920566 гена TAS1R2, являлся основным фактором при оценке сладости четырех растворов сахаров. Девушки лучше идентифицировали разницу во вкусе четырех сахаров, чем юноши. В то же время пол и ОНЗ rs4920566 совместно могут влиять на ПЧ к сахарозе. Девушки с аллелем A и генотипом A/G TAS1R2 имели более высокую чувствительность к сладкому вкусу по сравнению с юношами. Генотип G/G у девушек значимо ассоциирован с низкой чувствительностью к сладкому вкусу. ОНЗ rs4920566 гена TAS1R2 значимо не влияла на выбор сладких продуктов у обследуемых студентов. Собственные результаты и данные литературы позволяют полагать, что этот полиморфизм гена TAS1R2 не может быть информативным маркером для диагностики метаболических состояний, ассоциированных с потреблением высококалорийной сладкой пищи. Вероятно, полиморфизм rs4920566 гена TAS1R2 может быть связан с механизмами нейротрансдукции сладкого вкусового сигнала. Наши результаты могут быть полезными в понимании молекулярных механизмов метаболического синдрома у людей. Исследование и характеристика генетических факторов, предрасполагающих к определенным сладким вкусовым стимулам, может стать инструментом адаптации моделей питания для поощрения здоровых пищевых привычек.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена с привлечением средств ФИЦ УУХ СО РАН и кафедры бионанотехнологии КемГУ.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Франк К.А. — получение и интерпретация результатов, написание статьи; Гордеева Л.А. — концепция исследования, написание статьи; Воронина Е.Н. — внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи; Величкович Н.С.  — существенный вклад в дизайн исследования и его проведение; Соколова Е.А. — внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи; Поленок Е.Г. — получение и интерпретация результатов, написание статьи; Мун С.А. — получение и интерпретация результатов; Тамарзина Т.В. — концепция и дизайн исследования. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы выражают слова благодарности всем студентам, принявшим участие в исследовании.