Ассоциация носительства полиморфизма rs4646994 гена АСЕ с ожирением и андрогенным дефицитом у мужчин

ОБОСНОВАНИЕ

Пандемия ожирения, обусловленная изменением образа жизни населения развитых и развивающихся стран — неадекватным питанием, низкой физической активностью, частыми психоэмоциональными стрессами, депрессией и т.д., вызывает не только рост распространенности хронических неинфекционных заболеваний, включая сердечно-сосудистые, сахарный диабет 2 типа (СД2), атеросклероз [1], но и ускорение процессов биологического старения [2]. У мужчин старение ассоциированос развитием андрогенного дефицита (АнД), обусловленного снижением уровней половых стероидных гормонов — тестостерона и дегидроэпиандростерона в крови [3–5]. Формирование АнД способствует снижению интенсивности анаболических процессов и уменьшению мышечной массы, угнетению сексуальной функции, нарастанию эректильной дисфункции. Выявлена также связь между АнД и инсулинорезистентностью, дислипидемиями, метаболическим синдромом (МС), риском сосудистых осложнений [6][7]. При ожирении интенсивность процессов формирования возрастного АнД у мужчин дополнительно повышается в связи с конвертацией ароматазой адипоцитов жировой ткани тестостерона в эстрадиол [8]. В свою очередь, формирующийся АнД способствует большему накоплению жировой ткани в организме и усиливает развивающиеся на фоне ожирения метаболические нарушения [9][10]. Такое сочетание достоверно увеличивает количество обострений хронического заболевания и число госпитализаций [11]. Эти факты указывают на возможность наличия общих механизмов, определяющих предрасположенность к развитию ожирения и АнД. Особенно явно связь этих процессов прослеживается в настоящее время у молодых мужчин с ожирением, у которых снижение уровня тестостерона обнаруживается уже с юношеского возраста в период активного становления репродуктивной системы [11].

В предрасположенности к развитию ожирения у человека важную роль играют генетические факторы. К настоящему времени установлена ассоциация риска развития этого заболевания с генетическими полиморфизмами генов FTO, PPARG, FABP2, ADRB2, ADRB3, ACTN3, LEP, LEPR и других [12–15]. В этой связи вызывает интерес полиморфизм rs4646994 гена ACE, который, по последним данным, ассоциирован с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), гипертонической болезни (ГБ) и ожирения [16]. Полиморфизм rs4646994 гена ACE заключается в наличии (вставка, I) или отсутствии (делеция, D) фрагмента из 287 пар оснований в интроне 16 гена АСЕ [17]. Ген АСЕ кодирует ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), который катализирует образование сильнодействующего сосудосуживающего агента ангиотензина II (АГ II) из гормона ангиотензина I (АГ I). Это ключевой фермент ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), регулирующей объем циркулирующей крови и электролитный обмен в жидкостях организма и кровяное давление у людей, играет важнейшую роль в патогенезе ГБ. Сравнительно недавно было показано, что АПФ (напрямую и косвенно через АГ II) участвует в росте и созревании адипоцитов.По имеющимся литературным данным, уровни АПФ в сыворотке у гомозигот D/D (двойная делеция в полиморфизме rs4646994 гена АСЕ) в два раза выше, чем у гомозигот I/I, в то время как гетерозиготные индивидуумы имеют промежуточные уровни АПФ [18][19]. Отмечается, что лица, имеющие генотип АСЕ D/D, более склонны к ожирению, чем носители генотипов I/I и I/D [20]. Носительство аллеля D в генотипе полиморфного локуса rs4646994 гена АСЕ связано с увеличением активности сывороточного АПФ. Это отягощает течение артериальной гипертонии. В то же время в результате многочисленных одномоментных и когортных исследований подтверждена ассоциация ГБ, АнД и ожирения [21–23]. Помимо этого, доказана ассоциация носительства аллеля D в полиморфном локусе rs4646994 гена АСЕ с более тяжелым течением СД2 и атеросклероза сосудов различных локализаций [21][24]. В то же время в настоящее время крайне мало известно об ассоциации генетических факторов риска развития ожирения и ССЗ с АнД у мужчин. Актуальность настоящего исследования заключается в поиске генетических факторов (полиморфизма гена АСЕ) развития ожирения и АнД.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить ассоциацию носительства полиморфных вариантов локуса rs4646994 гена АСЕ с особенностями андрогенного и антропометрического статусов у мужчин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Исследование проведено на базе клиники ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины».

Время исследования. Набор материала продолжался с апреля 2020 г. по октябрь 2021 г.

Изучаемые популяции

Произведено изучение одной популяции мужчин — пациентов терапевтической клиники, проживающих на территории Сибири.

Критерии включения: 1) мужской пол; 2) возраст от 18 до 75 лет; 3) наличие как минимум одного хронического неинфекционного заболевания в анамнезе (ГБ, ишемическая болезнь сердца, дорсопатия, вегетососудистая дистония, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, другая соматическая патология).

Критерии исключения: 1) врожденный АнД; 2) прием андрогенных или антиандрогенных препаратов; 3) вторичное ожирение; 4) СД 1 типа; 5) прием препаратов, влияющих на массу тела (антидепрессанты, нейролептики, аноретики, ингибиторы желудочно-кишечных липаз и др.); 6) хирургическое лечение ожирения в анамнезе; 7) злокачественные новообразования любой локализации на момент включения в исследование; 8) тяжелая органная недостаточность (хроническая сердечная недостаточность IIб–III стадии, хроническая дыхательная недостаточность 2–3-й степени, хроническая болезнь почек 4–5 стадии, хроническая печеночная недостаточность 2–4 стадии); 9) тяжелые инфекционные процессы в активной фазе (туберкулез, гепатиты В и С, ВИЧ-инфекция); 10) отказ от проведения антропометрии и/или сдачи крови.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции

Выборка участников исследования сформирована сплошным методом из числа пациентов клиники, удовлетворяющих критериям включения.

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое интервенционное одномоментное одновыборочное неконтролируемое пилотное исследование.

Описание медицинского вмешательства

Утром натощак (8:00–8:30) проводили антропометрическое обследование, измеряли: рост, массу тела (МТ), окружность груди (ОГ), талии (ОТ) и бедер (ОБ), расчетным методом определяли индекс массы тела (ИМТ) как отношение массы тела (кг) к росту (м) в квадрате (кг/м²). Проводили забор венозной крови из кубитальной вены для оценки гормональных показателей андрогенного статуса и взятие образца буккального эпителия для молекулярно-генетического исследования.

Методы

Критерии соответствия определены на основании паспортных данных при помощи ретроспективного анализа историй болезни участников исследования с учетом результатов рутинных общеклинических, лабораторных и инструментальных методов обследования.

Коморбидную отягощенность оценивали путем ретроспективного анализа истории болезни с расчетом индекса коморбидности по шкале CIRS.

На основании ИМТ выделяли нормальную (18,0–24,9 кг/м²), избыточную (25,0–29,9 кг/м²) МТ и ожирение (≥30,0 кг/м²).

Гормональные показатели андрогенного статуса определяли иммуноферментным методом с использованием отечественных и зарубежных реактивов на микропланшетном иммуноферментном анализаторе «Immunochem-2100» (HTI, США). В сыворотке крови определяли содержание общего тестостерона (Тобщ., референсный интервал 12,1–38,3 нмоль/л); секс-стероид-связывающего глобулина (СССГ, референсный интервал 12,4–78,4 нмоль/л); дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА-С, референсный интервал 2,71–11,4 мкмоль/л); эстрадиола (Е2, референсный интервал 30,1–68,4 пг/мл); лютеинизирующего гормона (ЛГ, референсный интервал 0,8–8,4 мМЕ/мл). Определение свободного тестостерона (Тсв., референсный интервал ≥0,243 нмоль/л) производили расчетным методом с использованием калькулятора на сайте ISSAM (www.issam.ch). Частоту встречаемости АнД учитывали по критериям Тобщ.≤12,0 нмоль/л, Тсв.<0,243 нмоль/л и ДГЭА-С<2,71 мкмоль/л; гиперэстрогении (ГЭ) — по критерию Е2>68,4 пг/мл.

Для оценки генетических особенностей пациентов проводили молекулярно-генетическое исследование с определением наличия полиморфизма rs4646994 гена ACE. Образцы буккального эпителия исследовали не позднее 14 дней с момента забора материала, образцы сывороток крови — одномоментно после завершения сбора всего биологического материала. ДНК выделяли из клеток буккального эпителия с использованием коммерческого набора «РеалБест ДНК-экспресс» (Россия). Выявление носительства полиморфизма rs4646994 гена ACE проведено при помощи аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green c последующим электрофорезом продуктов ПЦР в полиакриламидном геле.

Структура олигонуклеотидов, использованных для проведения ПЦР:

F — 5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′;

R — 5′-ATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′.

Наличие D- и I-аллелей распознавали по выявлению на электрофореграмме ДНК продуктов ПЦР размером 190 и 490 пар оснований соответственно (рис. 1).

Анализ в подгруппах

На основании носительства полиморфизма rs4646994 гена ACE были выделены следующие группы (Г) пациентов: Г1 — гомозиготы по дикому типу (I/I), Г2 — гетерозиготы (I/D), Г3 — гомозиготы по мутантному аллелю (D/D).

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: предварительно не рассчитывали.

Этическая экспертиза

Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом (протокол №23 от 9.12.2021) Федерального исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины. Все пациенты перед включением в исследование были ознакомлены с целью, задачами и ходом исследования и дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследовании приняли участие 82 пациента. Средний возраст обследованных мужчин в выборке составил 54 [ 45; 60] года. Суммарный уровень коморбидной отягощенности по шкале CIRS составил 9,0 [ 6,0; 10,0] балла, а в группах 1, 2 и 3 — 8,0 [ 5,0; 10,0], 8,0 [ 5,0; 10,0] и 9,0 [ 6,5; 11,0] балла соответственно и не различался между выделенными группами (p_1–2=0,932; p_1–3=0,523; p_1–3=0,360). Доля пациентов с избыточной МТ и ожирением в общей выборке составила 39,5 и 48,2% соответственно. Процент АнД по критериям Тобщ., Тсв. и ДГЭА-С составил 40,0, 48,9 и 96% соответственно; ГЭ — 26,5%. По результатам генетического исследования в группу 1 (I/I, Г1) были включены 17 пациентов, в группу 2 (I/D, Г2) — 41 человек, в группу 3 (D/D, Г3) — 24 человека. У обследованных нами пациентов частота встречаемости варианта I/I локуса rs4646994 гена АСЕ составила 20,7% общего числа мужчин, варианта I/D — 50,0%, а варианта D/D — 29,3%.

В выделенных группах пациентов обнаружены отличия в антропометрическом статусе. Величины показателей массы тела пациентов, ОГ, ОТ, ОБ из Г2 и Г3 достоверно выше, чем из Г1 (табл. 1). Соответственно этому наблюдались и статистически значимые различия в значениях ИМТ между Г1 и Г3, Г1 и Г2. В прямой зависимости от числа D-аллелей в генотипе доля пациентов с избыточной массой тела и ожирением нарастала от 64,7% в Г1, 90,3% в Г2 до 100% в Г3 (рис. 2).

Данные сведения подтверждаются статистически значимыми высокими (более 0,300) положительными значениями величин коэффициентов корреляции между носительством аллеля D локуса rs4646994 и повышенными значениями ИМТ, а также остальных антропометрических характеристик (табл. 2).

При анализе гормональных характеристик андрогенного статуса у обследованных мужчин было отмечено, что пациенты из Г1 по сравнению с Г3 имеют статистически значимо более высокие уровни как общего, так и свободного тестостерона (табл. 1). Доля пациентов со сниженным уровнем Тобщ. увеличивается соответственно количеству аллелей D в генотипе: 12,5% в Г1, 33,3% в Г2 и 66,7% в Г3 (рис. 3).

Доля пациентов со сниженным уровнем Тсв. также увеличивается соответственно количеству аллелей D в генотипе: 25,0% в Г1, 37,0% в Г2 и 85,7% в Г3 (рис. 4). Данные сведения подтверждаются отрицательными величинами коэффициентов корреляции между носительством аллеля D локуса rs4646994 и уровнем Тсв. сыворотки (табл. 2).

Сведения о влиянии носительства аллеля D на уровень СССГ противоречивы: с одной стороны, обнаружены статистически значимо более высокие уровни СССГ в Г1 (медиана 48,7 нмоль/л) по сравнению с Г2 (медиана 29,18 нмоль/л), с другой стороны — различия между Г1 и Г3 статистически незначимы. Однако при этом выявлена достоверная обратная корреляционная связь между носительством аллеля D в исследуемом локусе и уровнем СССГ. Ввиду этого утверждение об однозначном влиянии носительства аллеля D на уровень СССГ сыворотки затруднительно.

Статистически значимых различий между группами в концентрациях ДГЭА-С, ЛГ и Е2 в сыворотке не получено. Достоверных корреляционных связей с другими изученными параметрами не обнаружено (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Репрезентативность выборок

Репрезентативность выборки ограничена малой численностью обследованных пациентов и одноцентровым дизайном исследования. Поэтому полученные данные могут быть интерпретированы с осторожностью и требуют подтверждения путем увеличения объема выборки за счет пациентов различных клиник г. Новосибирска с включением малых этнических групп, проживающих на территории Сибири, а также изучения роли других полиморфизмов гена ACE.

Сопоставление с другими публикациями

Полученные результаты аналогичны данным других авторов. Так, в работе [24] показано, что у здоровых лиц частота вариантов I/I, I/D и D/D составляла 15,9, 54,3 и 29,8% соответственно, при этом распределение вариантов I/D гена ACE у пациентов с острой сердечной недостаточностью (ОСН) по сравнению с отсутствием ОСН показало одинаковую частоту указанных вариантов, и только у пациентов с ОСН, но со сниженной фракцией выброса, чаще выявлялся полиморфизм D/D гена АСЕ. Установлено, что в общей выборке лиц сибирской популяции частота генотипов I/D полиморфизма гена ACE составила 24,5% для гомозиготного генотипа II, для гетерозиготного генотипа ID — 53,1 и 22,4% для генотипа DD [25]. Это приблизительно соответствует полученному нами распределению: 17 человек (20,8% общей выборки) в группе гомозигот I/I, 41 человек (50% общей выборки) в группе гетерозигот I/D, 24 человека (29,2% общей выборки) в группе гомозигот D/D.

В работе [17] было показано, что среди здоровых лиц вариант D/D ассоциирован с более высоким артериальным давлением и большей величиной относительной массы жира, а вариант I/I локуса rs4646994 гена АСЕ ассоциирован с более низким кардиометаболическим риском. Авторы также показали, что существует половой диморфизм во влиянии полиморфизма гена АСЕ I/D на окисление жиров. На ассоциацию носительства аллеля D с ожирением указывается в отечественных [26] и зарубежных работах [21][27]. Так, в работе Мулеровой Т.А приводится соотношение количества пациентов с метаболическим синдромом согласно генотипу АСЕ: у пациентов с генотипом I/I — 23,4%, у пациентов с генотипом I/D — 51,1%, с генотипом D/D — 25,5% [26]. В современной литературе нет упоминания о влиянии полиморфизма локуса rs4646994 на андрогенный статус у мужчин. Однако данную гипотезу косвенно подтверждает то, что носительство варианта D/D связано с повышением уровня АПФ сыворотки [19], а также сведения о взаимосвязи АнД и гиперактивации РААС (в частности АПФ) [28].

Согласно исследованию [29], в котором анализировалось влияние полиморфизмов повторов CAG и GGN гена рецептора андрогенов на окисление жиров, указанный половой диморфизм можно объяснить гормональными различиями между мужчинами и женщинами. В контексте с этими сведениями находятся результаты наших исследований о том, что имеется ассоциация аллеля D полиморфного локуса rs4646994 гена АСЕ с избыточной массой тела и АнД. Андрогены, участвующие в эндокринной регуляции сперматогенеза, необходимы для половой дифференцировки и мужского гаметогенеза, при этом биологическая функция андрогенов (в частности, тестостерона) зависит от андрогенного рецептора, кодируемого соответствующим геном, который содержит полиморфные тринуклеотидные повторы CAG, кодирующие полиглутаминовый участок в первом экзоне гена [30]. Имеются сведения, что полиморфизм повторов CAG связан с раком предстательной железы и мужским бесплодием. Однако мы не нашли сведений об ассоциации этого полиморфизма с избыточной МТ и ожирением.

Обсуждение основного результата исследования

У носителей полиморфизма D/D гена АСЕ повышена продукция АПФ, что приводит к увеличению уровня ангиотензина II и усугублению течения ГБ. В свою очередь, увеличение МТ за счет жирового компонента для его адекватного кровоснабжения требует увеличения объема циркулирующей крови и повышенного артериального давления. На этом фоне повышение периферического сосудистого сопротивления сопровождается гипоксией тканей, которая инициирует процессы фибро- и адипогенеза, хронического воспаления, ассоциированного с выработкой провоспалительных цитокинов, замыкая порочный круг [31] Приведенное выше описание может частично объяснить предрасположенность к накоплению избыточной МТ у носителей полиморфного варианта D/D гена АСЕ.

Статистически значимые различия в антропометрическом и гормональном статусах между Г1, с одной стороны, Г2 и Г3 — с другой стороны, а также результаты корреляционного анализа свидетельствуют об однонаправленной ассоциации аллеля D полиморфизма rs4646994 гена АСЕ с повышенным риском АнД и избыточной МТ. Однако при этом отличий между группами Г2 и Г3 не было обнаружено, следовательно, предполагать большую выраженность АнД и избыточной МТ у носителей генотипа D/D по сравнению с носителями генотипа I/D не представляется возможным (см. табл. 1). Схожие результаты получили авторы в исследовании влияния носительства полиморфных вариантов локуса rs4646994 гена ACE на тяжесть течения атеросклероза сосудов у пациентов с СД2: разница частот встречаемости дислипидемии у пациентов-носителей генотипа D/D и I/D была статистически незначимой [32]. Можно предположить, что для неблагоприятных фенотипических проявлений ввиде АнД, ССЗ, ожирения важно присутствие хотя бы одного аллеля D в локусе rs4646994 гена АСЕ, а увеличение их числа не имеет «накопительного» эффекта.

Клиническая значимость результатов

Полученные нами результаты подтверждают, что полиморфизм I/D гена АСЕ может влиять на предрасположенность к избыточной МТ, ожирению и АнД. При этом следует помнить, что генетика не полностью определяет фенотип людей, поскольку факторы окружающей среды играют в этом крайне важную роль. Особенно это касается ожирения, в развитии которого такие социальные факторы, как избыточное неадекватное энергетическим затратам питание и низкая физическая активность, имеют во многом определяющее значение [1].

Ограничения исследования

В данной работе представлена зависимость антропометрических показателей от генетического полиморфизма. Однако ожирение и андрогенный статус зависят и от таких факторов, как образ жизни, характер питания, приверженность к лечению сопутствующей соматической патологии, не учтенных в этом исследовании.

Направления дальнейших исследований

В дальнейшем планируется анализ взаимосвязи андрогенного и антропометрического статусов, а также зависимости качества жизни мужчин от полиморфных вариантов других генов, продукты которых участвуют в обмене веществ и поддержании гомеостаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Носительство аллеля D полиморфизма rs4646994 гена АСЕ ассоциировано со сниженными уровнями общего и свободного тестостерона сыворотки, а также предрасполагает к накоплению избыточной МТ и ожирению. Механизмы данного влияния не вполне понятны. Не исключено, что появление у пациента ожирения приводит к стимуляции РААС, а носительство неблагоприятного аллеля D гена ACE лишь усиливает образование АГ II из АГ I. При этом возможность связи количества аллелей D в локусе гена АСЕ (1 или 2) с выраженностью АнД и избытком МТ требует проведения дальнейших исследований.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение № 075-15-2021-691).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Мосалев К.И. — получение, анализ данных, интерпретация результатов, написание статьи; Янковская С.В. — концепция исследования, анализ данных, написание статьи; Иванов И.Д. — получение и анализ данных, написание статьи; Пинхасов Б.Б. — дизайн исследования, внесение в рукопись существенных правок с целью повышения научной ценности статьи; Селятицкая В.Г. — концепция и дизайн исследования, написание статьи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.