Пандемия ожирения, обусловленная изменением образа жизни населения развитых и развивающихся стран — неадекватным питанием, низкой физической активностью, частыми психоэмоциональными стрессами, депрессией и т.д., вызывает не только рост распространенности хронических неинфекционных заболеваний, включая сердечно-сосудистые, сахарный диабет 2 типа (СД2), атеросклероз [1], но и ускорение процессов биологического старения [2]. У мужчин старение ассоциированос развитием андрогенного дефицита (АнД), обусловленного снижением уровней половых стероидных гормонов — тестостерона и дегидроэпиандростерона в крови [3–5]. Формирование АнД способствует снижению интенсивности анаболических процессов и уменьшению мышечной массы, угнетению сексуальной функции, нарастанию эректильной дисфункции. Выявлена также связь между АнД и инсулинорезистентностью, дислипидемиями, метаболическим синдромом (МС), риском сосудистых осложнений [6][7]. При ожирении интенсивность процессов формирования возрастного АнД у мужчин дополнительно повышается в связи с конвертацией ароматазой адипоцитов жировой ткани тестостерона в эстрадиол [8]. В свою очередь, формирующийся АнД способствует большему накоплению жировой ткани в организме и усиливает развивающиеся на фоне ожирения метаболические нарушения [9][10]. Такое сочетание достоверно увеличивает количество обострений хронического заболевания и число госпитализаций [11]. Эти факты указывают на возможность наличия общих механизмов, определяющих предрасположенность к развитию ожирения и АнД. Особенно явно связь этих процессов прослеживается в настоящее время у молодых мужчин с ожирением, у которых снижение уровня тестостерона обнаруживается уже с юношеского возраста в период активного становления репродуктивной системы [11].

В предрасположенности к развитию ожирения у человека важную роль играют генетические факторы. К настоящему времени установлена ассоциация риска развития этого заболевания с генетическими полиморфизмами генов FTO, PPARG, FABP2, ADRB2, ADRB3, ACTN3, LEP, LEPR и других [12–15]. В этой связи вызывает интерес полиморфизм rs4646994 гена ACE, который, по последним данным, ассоциирован с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), гипертонической болезни (ГБ) и ожирения [16]. Полиморфизм rs4646994 гена ACE заключается в наличии (вставка, I) или отсутствии (делеция, D) фрагмента из 287 пар оснований в интроне 16 гена АСЕ [17]. Ген АСЕ кодирует ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), который катализирует образование сильнодействующего сосудосуживающего агента ангиотензина II (АГ II) из гормона ангиотензина I (АГ I). Это ключевой фермент ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), регулирующей объем циркулирующей крови и электролитный обмен в жидкостях организма и кровяное давление у людей, играет важнейшую роль в патогенезе ГБ. Сравнительно недавно было показано, что АПФ (напрямую и косвенно через АГ II) участвует в росте и созревании адипоцитов.По имеющимся литературным данным, уровни АПФ в сыворотке у гомозигот D/D (двойная делеция в полиморфизме rs4646994 гена АСЕ) в два раза выше, чем у гомозигот I/I, в то время как гетерозиготные индивидуумы имеют промежуточные уровни АПФ [18][19]. Отмечается, что лица, имеющие генотип АСЕ D/D, более склонны к ожирению, чем носители генотипов I/I и I/D [20]. Носительство аллеля D в генотипе полиморфного локуса rs4646994 гена АСЕ связано с увеличением активности сывороточного АПФ. Это отягощает течение артериальной гипертонии. В то же время в результате многочисленных одномоментных и когортных исследований подтверждена ассоциация ГБ, АнД и ожирения [21–23]. Помимо этого, доказана ассоциация носительства аллеля D в полиморфном локусе rs4646994 гена АСЕ с более тяжелым течением СД2 и атеросклероза сосудов различных локализаций [21][24]. В то же время в настоящее время крайне мало известно об ассоциации генетических факторов риска развития ожирения и ССЗ с АнД у мужчин. Актуальность настоящего исследования заключается в поиске генетических факторов (полиморфизма гена АСЕ) развития ожирения и АнД.

Изучить ассоциацию носительства полиморфных вариантов локуса rs4646994 гена АСЕ с особенностями андрогенного и антропометрического статусов у мужчин.

Место проведения. Исследование проведено на базе клиники ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины».

Время исследования. Набор материала продолжался с апреля 2020 г. по октябрь 2021 г.

Произведено изучение одной популяции мужчин — пациентов терапевтической клиники, проживающих на территории Сибири.

Критерии включения: 1) мужской пол; 2) возраст от 18 до 75 лет; 3) наличие как минимум одного хронического неинфекционного заболевания в анамнезе (ГБ, ишемическая болезнь сердца, дорсопатия, вегетососудистая дистония, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, другая соматическая патология).

Критерии исключения: 1) врожденный АнД; 2) прием андрогенных или антиандрогенных препаратов; 3) вторичное ожирение; 4) СД 1 типа; 5) прием препаратов, влияющих на массу тела (антидепрессанты, нейролептики, аноретики, ингибиторы желудочно-кишечных липаз и др.); 6) хирургическое лечение ожирения в анамнезе; 7) злокачественные новообразования любой локализации на момент включения в исследование; 8) тяжелая органная недостаточность (хроническая сердечная недостаточность IIб–III стадии, хроническая дыхательная недостаточность 2–3-й степени, хроническая болезнь почек 4–5 стадии, хроническая печеночная недостаточность 2–4 стадии); 9) тяжелые инфекционные процессы в активной фазе (туберкулез, гепатиты В и С, ВИЧ-инфекция); 10) отказ от проведения антропометрии и/или сдачи крови.

Выборка участников исследования сформирована сплошным методом из числа пациентов клиники, удовлетворяющих критериям включения.

Проведено одноцентровое интервенционное одномоментное одновыборочное неконтролируемое пилотное исследование.

Утром натощак (8:00–8:30) проводили антропометрическое обследование, измеряли: рост, массу тела (МТ), окружность груди (ОГ), талии (ОТ) и бедер (ОБ), расчетным методом определяли индекс массы тела (ИМТ) как отношение массы тела (кг) к росту (м) в квадрате (кг/м²). Проводили забор венозной крови из кубитальной вены для оценки гормональных показателей андрогенного статуса и взятие образца буккального эпителия для молекулярно-генетического исследования.

Критерии соответствия определены на основании паспортных данных при помощи ретроспективного анализа историй болезни участников исследования с учетом результатов рутинных общеклинических, лабораторных и инструментальных методов обследования.

Коморбидную отягощенность оценивали путем ретроспективного анализа истории болезни с расчетом индекса коморбидности по шкале CIRS.

На основании ИМТ выделяли нормальную (18,0–24,9 кг/м²), избыточную (25,0–29,9 кг/м²) МТ и ожирение (≥30,0 кг/м²).

Гормональные показатели андрогенного статуса определяли иммуноферментным методом с использованием отечественных и зарубежных реактивов на микропланшетном иммуноферментном анализаторе «Immunochem-2100» (HTI, США). В сыворотке крови определяли содержание общего тестостерона (Тобщ., референсный интервал 12,1–38,3 нмоль/л); секс-стероид-связывающего глобулина (СССГ, референсный интервал 12,4–78,4 нмоль/л); дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА-С, референсный интервал 2,71–11,4 мкмоль/л); эстрадиола (Е2, референсный интервал 30,1–68,4 пг/мл); лютеинизирующего гормона (ЛГ, референсный интервал 0,8–8,4 мМЕ/мл). Определение свободного тестостерона (Тсв., референсный интервал ≥0,243 нмоль/л) производили расчетным методом с использованием калькулятора на сайте ISSAM (www.issam.ch). Частоту встречаемости АнД учитывали по критериям Тобщ.≤12,0 нмоль/л, Тсв.<0,243 нмоль/л и ДГЭА-С<2,71 мкмоль/л; гиперэстрогении (ГЭ) — по критерию Е2>68,4 пг/мл.

Для оценки генетических особенностей пациентов проводили молекулярно-генетическое исследование с определением наличия полиморфизма rs4646994 гена ACE. Образцы буккального эпителия исследовали не позднее 14 дней с момента забора материала, образцы сывороток крови — одномоментно после завершения сбора всего биологического материала. ДНК выделяли из клеток буккального эпителия с использованием коммерческого набора «РеалБест ДНК-экспресс» (Россия). Выявление носительства полиморфизма rs4646994 гена ACE проведено при помощи аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green c последующим электрофорезом продуктов ПЦР в полиакриламидном геле.

Структура олигонуклеотидов, использованных для проведения ПЦР:

F — 5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′;

R — 5′-ATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′.

Наличие D- и I-аллелей распознавали по выявлению на электрофореграмме ДНК продуктов ПЦР размером 190 и 490 пар оснований соответственно (рис. 1).

На основании носительства полиморфизма rs4646994 гена ACE были выделены следующие группы (Г) пациентов: Г1 — гомозиготы по дикому типу (I/I), Г2 — гетерозиготы (I/D), Г3 — гомозиготы по мутантному аллелю (D/D).

Принципы расчета размера выборки: предварительно не рассчитывали.

Методы статистического анализа данных: статистическая обработка данных проведена с использованием программ Excel 2013 (Microsoft, США) и Statistica 10 (StatSoft, США). Для оценки нормальности распределения выборки был использован критерий Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса, который указал на отличное от нормального распределение большинства изученных параметров. Количественные характеристики представлены в виде медианы, 25 и 75 перцентилей — Me [Ql; Qh]), в также абсолютного (n) и относительного числа случаев (%). Парное сравнение двух независимых групп по количественным признакам проведено с использованием критерия Манна–Уитни, при сравнении 3 независимых групп вводили поправку Бонферрони на множественное сравнение. Сравнение независимых групп по качественным признакам проведено при помощи метода χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность. Силу ассоциации носительства определенных аллельных вариантов с фенотипическими проявлениями оценивали с использованием корреляционного анализа и расчета коэффициента корреляции Спирмена r. За критический уровень значимости было принято p<0,05; при множественном сравнении — p<0,017.

Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом (протокол №23 от 9.12.2021) Федерального исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины. Все пациенты перед включением в исследование были ознакомлены с целью, задачами и ходом исследования и дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

В исследовании приняли участие 82 пациента. Средний возраст обследованных мужчин в выборке составил 54 [ 45; 60] года. Суммарный уровень коморбидной отягощенности по шкале CIRS составил 9,0 [ 6,0; 10,0] балла, а в группах 1, 2 и 3 — 8,0 [ 5,0; 10,0], 8,0 [ 5,0; 10,0] и 9,0 [ 6,5; 11,0] балла соответственно и не различался между выделенными группами (p1–2=0,932; p1–3=0,523; p1–3=0,360). Доля пациентов с избыточной МТ и ожирением в общей выборке составила 39,5 и 48,2% соответственно. Процент АнД по критериям Тобщ., Тсв. и ДГЭА-С составил 40,0, 48,9 и 96% соответственно; ГЭ — 26,5%. По результатам генетического исследования в группу 1 (I/I, Г1) были включены 17 пациентов, в группу 2 (I/D, Г2) — 41 человек, в группу 3 (D/D, Г3) — 24 человека. У обследованных нами пациентов частота встречаемости варианта I/I локуса rs4646994 гена АСЕ составила 20,7% общего числа мужчин, варианта I/D — 50,0%, а варианта D/D — 29,3%.

В выделенных группах пациентов обнаружены отличия в антропометрическом статусе. Величины показателей массы тела пациентов, ОГ, ОТ, ОБ из Г2 и Г3 достоверно выше, чем из Г1 (табл. 1). Соответственно этому наблюдались и статистически значимые различия в значениях ИМТ между Г1 и Г3, Г1 и Г2. В прямой зависимости от числа D-аллелей в генотипе доля пациентов с избыточной массой тела и ожирением нарастала от 64,7% в Г1, 90,3% в Г2 до 100% в Г3 (рис. 2).

Данные сведения подтверждаются статистически значимыми высокими (более 0,300) положительными значениями величин коэффициентов корреляции между носительством аллеля D локуса rs4646994 и повышенными значениями ИМТ, а также остальных антропометрических характеристик (табл. 2).

При анализе гормональных характеристик андрогенного статуса у обследованных мужчин было отмечено, что пациенты из Г1 по сравнению с Г3 имеют статистически значимо более высокие уровни как общего, так и свободного тестостерона (табл. 1). Доля пациентов со сниженным уровнем Тобщ. увеличивается соответственно количеству аллелей D в генотипе: 12,5% в Г1, 33,3% в Г2 и 66,7% в Г3 (рис. 3).

Доля пациентов со сниженным уровнем Тсв. также увеличивается соответственно количеству аллелей D в генотипе: 25,0% в Г1, 37,0% в Г2 и 85,7% в Г3 (рис. 4). Данные сведения подтверждаются отрицательными величинами коэффициентов корреляции между носительством аллеля D локуса rs4646994 и уровнем Тсв. сыворотки (табл. 2).

Сведения о влиянии носительства аллеля D на уровень СССГ противоречивы: с одной стороны, обнаружены статистически значимо более высокие уровни СССГ в Г1 (медиана 48,7 нмоль/л) по сравнению с Г2 (медиана 29,18 нмоль/л), с другой стороны — различия между Г1 и Г3 статистически незначимы. Однако при этом выявлена достоверная обратная корреляционная связь между носительством аллеля D в исследуемом локусе и уровнем СССГ. Ввиду этого утверждение об однозначном влиянии носительства аллеля D на уровень СССГ сыворотки затруднительно.

Статистически значимых различий между группами в концентрациях ДГЭА-С, ЛГ и Е2 в сыворотке не получено. Достоверных корреляционных связей с другими изученными параметрами не обнаружено (табл. 2).

Репрезентативность выборки ограничена малой численностью обследованных пациентов и одноцентровым дизайном исследования. Поэтому полученные данные могут быть интерпретированы с осторожностью и требуют подтверждения путем увеличения объема выборки за счет пациентов различных клиник г. Новосибирска с включением малых этнических групп, проживающих на территории Сибири, а также изучения роли других полиморфизмов гена ACE.

Полученные результаты аналогичны данным других авторов. Так, в работе [24] показано, что у здоровых лиц частота вариантов I/I, I/D и D/D составляла 15,9, 54,3 и 29,8% соответственно, при этом распределение вариантов I/D гена ACE у пациентов с острой сердечной недостаточностью (ОСН) по сравнению с отсутствием ОСН показало одинаковую частоту указанных вариантов, и только у пациентов с ОСН, но со сниженной фракцией выброса, чаще выявлялся полиморфизм D/D гена АСЕ. Установлено, что в общей выборке лиц сибирской популяции частота генотипов I/D полиморфизма гена ACE составила 24,5% для гомозиготного генотипа II, для гетерозиготного генотипа ID — 53,1 и 22,4% для генотипа DD [25]. Это приблизительно соответствует полученному нами распределению: 17 человек (20,8% общей выборки) в группе гомозигот I/I, 41 человек (50% общей выборки) в группе гетерозигот I/D, 24 человека (29,2% общей выборки) в группе гомозигот D/D.

В работе [17] было показано, что среди здоровых лиц вариант D/D ассоциирован с более высоким артериальным давлением и большей величиной относительной массы жира, а вариант I/I локуса rs4646994 гена АСЕ ассоциирован с более низким кардиометаболическим риском. Авторы также показали, что существует половой диморфизм во влиянии полиморфизма гена АСЕ I/D на окисление жиров. На ассоциацию носительства аллеля D с ожирением указывается в отечественных [26] и зарубежных работах [21][27]. Так, в работе Мулеровой Т.А приводится соотношение количества пациентов с метаболическим синдромом согласно генотипу АСЕ: у пациентов с генотипом I/I — 23,4%, у пациентов с генотипом I/D — 51,1%, с генотипом D/D — 25,5% [26]. В современной литературе нет упоминания о влиянии полиморфизма локуса rs4646994 на андрогенный статус у мужчин. Однако данную гипотезу косвенно подтверждает то, что носительство варианта D/D связано с повышением уровня АПФ сыворотки [19], а также сведения о взаимосвязи АнД и гиперактивации РААС (в частности АПФ) [28].

Согласно исследованию [29], в котором анализировалось влияние полиморфизмов повторов CAG и GGN гена рецептора андрогенов на окисление жиров, указанный половой диморфизм можно объяснить гормональными различиями между мужчинами и женщинами. В контексте с этими сведениями находятся результаты наших исследований о том, что имеется ассоциация аллеля D полиморфного локуса rs4646994 гена АСЕ с избыточной массой тела и АнД. Андрогены, участвующие в эндокринной регуляции сперматогенеза, необходимы для половой дифференцировки и мужского гаметогенеза, при этом биологическая функция андрогенов (в частности, тестостерона) зависит от андрогенного рецептора, кодируемого соответствующим геном, который содержит полиморфные тринуклеотидные повторы CAG, кодирующие полиглутаминовый участок в первом экзоне гена [30]. Имеются сведения, что полиморфизм повторов CAG связан с раком предстательной железы и мужским бесплодием. Однако мы не нашли сведений об ассоциации этого полиморфизма с избыточной МТ и ожирением.

У носителей полиморфизма D/D гена АСЕ повышена продукция АПФ, что приводит к увеличению уровня ангиотензина II и усугублению течения ГБ. В свою очередь, увеличение МТ за счет жирового компонента для его адекватного кровоснабжения требует увеличения объема циркулирующей крови и повышенного артериального давления. На этом фоне повышение периферического сосудистого сопротивления сопровождается гипоксией тканей, которая инициирует процессы фибро- и адипогенеза, хронического воспаления, ассоциированного с выработкой провоспалительных цитокинов, замыкая порочный круг [31] Приведенное выше описание может частично объяснить предрасположенность к накоплению избыточной МТ у носителей полиморфного варианта D/D гена АСЕ.

Статистически значимые различия в антропометрическом и гормональном статусах между Г1, с одной стороны, Г2 и Г3 — с другой стороны, а также результаты корреляционного анализа свидетельствуют об однонаправленной ассоциации аллеля D полиморфизма rs4646994 гена АСЕ с повышенным риском АнД и избыточной МТ. Однако при этом отличий между группами Г2 и Г3 не было обнаружено, следовательно, предполагать большую выраженность АнД и избыточной МТ у носителей генотипа D/D по сравнению с носителями генотипа I/D не представляется возможным (см. табл. 1). Схожие результаты получили авторы в исследовании влияния носительства полиморфных вариантов локуса rs4646994 гена ACE на тяжесть течения атеросклероза сосудов у пациентов с СД2: разница частот встречаемости дислипидемии у пациентов-носителей генотипа D/D и I/D была статистически незначимой [32]. Можно предположить, что для неблагоприятных фенотипических проявлений ввиде АнД, ССЗ, ожирения важно присутствие хотя бы одного аллеля D в локусе rs4646994 гена АСЕ, а увеличение их числа не имеет «накопительного» эффекта.

Полученные нами результаты подтверждают, что полиморфизм I/D гена АСЕ может влиять на предрасположенность к избыточной МТ, ожирению и АнД. При этом следует помнить, что генетика не полностью определяет фенотип людей, поскольку факторы окружающей среды играют в этом крайне важную роль. Особенно это касается ожирения, в развитии которого такие социальные факторы, как избыточное неадекватное энергетическим затратам питание и низкая физическая активность, имеют во многом определяющее значение [1].

В данной работе представлена зависимость антропометрических показателей от генетического полиморфизма. Однако ожирение и андрогенный статус зависят и от таких факторов, как образ жизни, характер питания, приверженность к лечению сопутствующей соматической патологии, не учтенных в этом исследовании.

В дальнейшем планируется анализ взаимосвязи андрогенного и антропометрического статусов, а также зависимости качества жизни мужчин от полиморфных вариантов других генов, продукты которых участвуют в обмене веществ и поддержании гомеостаза.

Носительство аллеля D полиморфизма rs4646994 гена АСЕ ассоциировано со сниженными уровнями общего и свободного тестостерона сыворотки, а также предрасполагает к накоплению избыточной МТ и ожирению. Механизмы данного влияния не вполне понятны. Не исключено, что появление у пациента ожирения приводит к стимуляции РААС, а носительство неблагоприятного аллеля D гена ACE лишь усиливает образование АГ II из АГ I. При этом возможность связи количества аллелей D в локусе гена АСЕ (1 или 2) с выраженностью АнД и избытком МТ требует проведения дальнейших исследований.

Источники финансирования. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение № 075-15-2021-691).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Мосалев К.И. — получение, анализ данных, интерпретация результатов, написание статьи; Янковская С.В. — концепция исследования, анализ данных, написание статьи; Иванов И.Д. — получение и анализ данных, написание статьи; Пинхасов Б.Б. — дизайн исследования, внесение в рукопись существенных правок с целью повышения научной ценности статьи; Селятицкая В.Г. — концепция и дизайн исследования, написание статьи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.