Полиморфизм гена витамин D-связывающего белка у пациентов – жителей калининградской области с острым коронарным синдромом

ОБОСНОВАНИЕ

Низкий уровень метаболитов витамина D (25(OH)D и 1,25(ОН)₂D) ассоциирован с повышением риска сердечно-сосудистых событий [1–7]. Морфологическим субстратом для данных событий является атерома интимы сосудов. На данный момент ведущая роль в атерогенезе отводится воспалению. Мигрировавшие в интиму сосудов моноциты и другие лейкоциты синтезируют широкий спектр провоспалительных цитокинов, выполняя ключевую роль в прогрессии атеросклероза [8]. Антиатерогенные эффекты витамина D достигаются за счет регуляции иммунологических/воспалительных реакций [9]. Витамин D ингибирует субъединицу p22 НАДФН-оксидазы, улучшает димеризацию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), что способствует синтезу NO и снижению образования активных форм кислорода. 1,25(ОН)₂D блокирует сигнальный путь NF-kB, в результате чего снижается экспрессия провоспалительных цитокинов ИЛ-6,-8, RANTES, молекул клеточной адгезии ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1 и Е-селектина. За счет снижения экспрессии циклооксигеназы-2 и повышения экспрессии 15-гидроксипростагландин-дегидрогеназы, снижается уровень простагландинов и части других провоспалительных цитокинов [10]. Также витамин D оказывает влияние на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему, снижая артериальное давление [11].

Большая часть (85–90%) 25(OH)D и 1,25(OH)₂D связана с витамин D-связывающим белком (VDBP), меньшая часть (10–15%) – с альбумином, и около 1% находится в несвязанном виде [12, 13]. Считается, что связанные фракции недоступны для клеток [14, 15]. VDBP играет важную роль не только в непосредственной транспортировке витамина D, но также имеет большое количество иных функций. VDBP связывает свободный актин, транспортирует жирные кислоты [15, 16]. Доказана роль участия VDBP в иммунных реакциях в качестве активатора макрофагального звена иммунитета [17]. Было предположено, что различные полиморфизмы оказывают разное влияние на активацию макрофагов [18]. Известно, что VDBP становится макрофагальным активирующим фактором лишь после дегликозилирования с помощью галактозидаз и сиалидаз Т- и В-лимфоцитов. С этой позиции особенно выделяется Gс2 форма VDBP, которая может быть гликозилирована только в одной 418 позиции в отличие от Gc1, которая может быть гликозилирована по двум позициям – 418 и 420. Соответственно, после частичного дегликозилирования продукт Gc2 варианта VDBP имеет сниженную активность в отношении активации макрофагов [19].

VDBP имеет около 124 вариантов аллелей, при этом самыми распространенными являются полиморфизмы Gc1*1F, Gc*1S, Gc*2 [20]. Различные варианты данного белка имеют разную активность в отношении выполняемых им функций [21].

ЦЕЛЬ

Исследовать полиморфизм витамин D-связывающего белка у пациентов с ОКС без сахарного диабета и определить взаимосвязь между аллелем витамин D-связывающего белка и особенностями ОКС у данной группы больных.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Одномоментное обсервационное одноцентровое неконтролируемое исследование.

Критерии соответствия

Критерием включения явилось наличие диагноза «острый коронарный синдром» при поступлении. Критериями исключения в исследование явилось наличие сахарного диабета, аутоиммунных заболеваний и злокачественных новообразований, подтвержденных клинически.

Условия проведения

Исследование проведено на базе ГБУЗ «ОКБ Калининградской области». Все пациенты являлись жителями Калининградской области – региона с низкой инсоляцией.

Продолжительность исследования

Исследование проведено в период с ноября 2017 г. по март 2018 г.

Объекты (участники) исследования

В исследование включено 50 пациентов – жителей Калининградской области, с диагнозом ОКС, из них 36 (72%) мужчин и 14 (28%) женщин. Средний возраст пациентов составил 60 (55;66) лет. Самому молодому пациенту на момент включения в исследование было 42 года, самому пожилому – 83 года. Доля пациентов среднего возраста (от 45 до 60 лет) составила 50% (25 пациентов), пожилого возраста (старше 60 лет) – 44% (22 пациента), молодого возраста (до 45 лет) – 6% (3 пациента).

При расспросе впервые возникшие боли за грудиной отметили 32 (64%) пациента. Диагноз ишемической болезни сердца (ИБС) до момента включения в исследование был выставлен 18 (36%) пациентам, из них 12 (24%) ранее перенесли инфаркт миокарда. Длительность заболевания ИБС в среднем составила 14 мес. ОКС с подъемом сегмента ST был диагностирован у 13 (26%) пациентов.

Артериальная гипертензия наблюдалась у 44 (88%) пациентов, из них артериальная гипертензия 3 степени была диагностирована у 35 (70%) пациентов, 2 степени – у 6 (12%) пациентов.

Избыточная масса тела была выявлена у 20 (40%) пациентов, ожирение I степени – у 8 (16%) пациентов, ожирение II степени – у 2 (4%) пациентов.

Описание медицинского вмешательства

Эхокардиографическое исследование проводилось на ультразвуковом аппарате Samsung Medison Accuvix XG. Протокол эхокардиографического исследования включал расчет индекса массы миокарда левого желудочка (ИММЛЖ), фракция выброса (ФВ) левого желудочка рассчитывалась по формуле Teichholz. Селективная коронароангиография выполнялась на ангиографе General Electric Innova 3100 IQ с использованием контрастного вещества Омнипак.

Исследование уровня витамина D₃ (25(OH)D) в сыворотке крови проводилось методом иммуноферментного анализа с использованием фотометра для микропланшетов Model 680 Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и автоматизированной станции для мойки микропланшетов Bio-Plex Pro II Microplate Wash Station (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Генотипирование производилось по следующей методике: геномная ДНК была выделена из замороженной цельной крови (хранившейся при -20ºС в вакутейнерах с К3 ЭДТА) с использованием набора реагентов GeneJet для выделения геномной ДНК из цельной крови (Thermo Fischer, Waltham, MA, США) в соответствии с протоколом производителя. Генотипирование двух однонуклеотидных полиморфизмов VDBP SNPs p.T436K (rs4588) и p.D432E (rs7041) производилось с помощью секвенирования. Амплификацию фрагментов размером 350-bp проводили, используя следующие праймеры: VDBP-F: 5′-GGCA TGTTTCACTTTCTGATCTC-3′ и VDBP-R: 5′-TGCCATGTTAAGTGGAGGGT-3′. ПЦР проводили в амплификаторе T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси, используя смесь для ПЦР Master Mix c Taq ДНК-полимеразой (2,5 е.а./мкл) (Thermo Fischer, Waltham, MA, USA) в следующих условиях: начальная денатурация – 1 мин 95°С, далее 30 циклов – 30 с при 95°С, отжиг праймеров 58°С 30 с и 30 с элонгация при 72°С; далее последний цикл синтеза 5 мин 72°С. После очищения ДНК путем реакции с ExoSap, циклический сиквенс производился с использованием набора BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Далее нуклеотидная последовательность определялась на секвенаторе Hitachi 3730 Genetic Analyzer и была проанализирована с помощью программного обеспечения SnapGene, version 4.1 (GSL Biotech LLC).

Основной исход исследования

Выявление полиморфизма гена витамин D-связывающего белка и оценка влияния его на клиническое течение ОКС.

Этическая экспертиза

Все пациенты подписали информированное согласие.

Решение комиссии по этике Балтийского федерального университета им. И. Канта: утвердить положительное заключение о возможности проведения исследования «Оценка полиморфизма гена витамин Д-связывающего белка, дефицита витамина D и ионных нарушений у лиц старше 50 лет с выраженным атеросклерозом и их связь с возникновением сердечно-сосудистых событий у данной категории пациентов – жителей Калининградской области».

Протокол заседания комиссии по этике БФУ им. И. Канта № 5 от 29.06.2018.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: статистический анализ полученных данных проводился с использованием пакета прикладных статистических программ StatSoft STATISTICA 7,0. Непрерывные переменные представлены в виде медианы и межквартильных интервалов (Ме (25%;75%). Номинальные данные представлены в виде относительных частот объектов исследования (n, %).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Основные результаты исследования

В качестве критериев дефицита витамина D использованы критерии Российской ассоциации эндокринологов, 2015 [22]. Дефицит витамина D (уровень ниже 20 нг/мл) выявлен у 41 (82%), из них критически низкий уровень (менее 10 нг/мл) – у 3 (7%) пациентов, недостаточность витамина D (уровень витамина 21–29 нг/мл) – у 8 (16%), достаточное содержание витамина D (более >30 нг/мл) – у 1 (2%) пациента.

При генотипировании однонуклеотидных полиморфизмов VDBP SNPs p.T436K (rs4588) и p.D432E (rs7041) методом секвенирования по Сенгеру полиморфизм генов был выявлен у 43 (86%) из 50 пациентов, включенных в исследование. Полиморфизм rs4588 (C>A) выявлен у 16 (32%) из 50 пациентов с ОКС. Полиморфизм rs7041(T>G) был выделен у 27 (54%) из 50 пациентов с ОКС. Полиморфизм rs4588 и rs7041 – у 7 (14%) пациентов, включенных в исследование.

Пациенты были распределены по группам в соответствии с выявленным вариантом аллеля гена VDBP. Вариант аллеля Gc1s/2 (rs7041G-rs4588A) был найден у 7 (14%) пациентов, Gc2 (rs7041T-rs4588A) – 9 (18%) пациентов, Gc1s (rs7041G-rs4588C) – 20 (40%) пациентов, Gc1f (rs7041T-rs4588C) – соответственно у 14 (28%). Основные характеристики групп представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные характеристики групп

Группы больных не различались по возрасту. В группе с гаплотипом Gc1f, который считается самым благоприятным, относительно чаще встречались мужчины. Статистически значимых различий по степени АГ между группами не выявлено, однако у всех пациентов из группы с вариантом аллеля Gc2 была выявлена АГ. Повторный инфаркт миокарда чаще встречался у пациентов из групп с выявленным интересующим полиморфизмом, т. е. Gc1s/2, Gc2, Gc1s – 29%, 33% и 25% соответственно. Ожирение чаще встречалось у пациентов с гаплотипами Gc2 (33%), Gc1f (29%), однако избыточный вес был выявлен у пациентов из групп Gc1s/2 (43%) и Gc1s (45%). Наименьший уровень холестерина выявлен у группы Gc2 – 4,75(4,0;5,5) ммоль/л, что можно объяснить вероятным приемом статинов и большей комплаентностью к лечению данной группы пациентов с АГ на фоне перенесенного ИМ, хотя оценка лечения не входила в задачи нашего исследования.

Гипертрофия левого желудочка чаще выявлялась у больных из групп Gc1s и Gc1f – 70% и 69% соответственно. Наиболее выраженное поражение коронарных артерий было выявлено у больных с гаплотипом Gc2, включая тотальную окклюзию коронарных артерий.

В группах пациентов с гаплотипами Gc2 и Gc1s у большинства был выявлен дефицит витамина D – 89% и 90% соответственно (табл. 2), однако наименьший средний уровень витамина D выявлен у лиц с вариантом аллеля Gc2 13,3 (13,0;16,8) нг/мл.

Таблица 2. Уровень витамина D в группах, n (%)

ОБСУЖДЕНИЕ

На данный момент имеется ограниченное количество работ, связывающих витамин D связывающий белок VDBP с предрасположенностью, течением и особенностями различных заболеваний. В одной работе показано снижение частоты развития бронхолегочной дисплазии у пациентов с Gc2 вариантом VDBP [23]. В другом исследовании предположено, что Gс*1F вариант может быть фактором риска развития хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) [24]. Есть данные о том, что данный белок является фактором риска развития метаболического синдрома, который, как известно, осложняется ранними сердечно-сосудистыми заболеваниями [25]. На сегодняшний день отсутствуют какие-либо данные, позволяющие связать полиморфизмы VDBP с особенностями течения острого коронарного синдрома. В нескольких исследованиях показано, что полиморфизмы rs7041 и rs4588 не связаны ни с уровнем витамина D в крови, ни с объемом поражения коронарных артерий атеросклерозом. В данных исследованиях эта связь была доказана лишь для самого витамина D [26–29]. Однако результаты относительно недавно проведенного в Китае популяционного исследования указывают на то, что дефицит витамина D чаще выявлялся у лиц с Gc2 вариантом гена VDBP [30]. Учитывая небольшой размер выборки пациентов, статистически значимых различий между группами получено не было. Однако нами было показано, что у лиц с ОКС чаще встречается дефицит витамина D, а также тенденция к более низкому его уровню у пациентов с вариантом аллеля Gc2. К тому же среди пациентов данной группы относительно чаще встречалось ожирение, тотальная окклюзия коронарных артерий и предшествующие инфаркты миокарда в анамнезе. В связи с этим можно предположить, что Gc2 вариант является прогностически более неблагоприятным для течения ИБС. Для подтверждения этого предположения необходимы дальнейшие исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, среди группы пациентов с ОКС частота полиморфизма гена Gс rs4588 и rs7041 была высокой и составила в нашем исследовании 86%. У 82% пациентов среднего и пожилого возраста, поступивших в стационар с ОКС, был диагностирован дефицит витамина D. Особенностью группы пациентов с вариантом аллеля VDBP Gc2 являлась относительно высокая частота повторных инфарктов миокарда и тотальной окклюзии коронарных артерий, а также тенденция к более низкому уровню витамина D₃ (25(OH)D) в сыворотке крови.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке программы 5–100 «Проект повышения конкурентоспособности ведущих российских университетов среди ведущих мировых научно-образовательных центров» на базе ФГАОУ «БФУ им. И Канта».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Богачев Роберт Стефанович – формирование плана и структуры исследования, проведение анализа полученных клинических и параклинических данных; Литвинова Лариса Сергеевна – исследование уровня 25-OH витамина D методом иммуноферментного анализа; Козел Анастасия Юрьевна – генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов VDBP SNPs p.T436K (rs4588) и p.D432E (rs7041) методом секвенирования, анализ полученных данных; Шитова Елена Сергеевна – проведение статистического анализа; Михайлова Лариса Викторовна – проведение статистического анализа; Анкудович Виталий – набор пациентов, анкетирование, проведение физикального обследования, обзор литературных данных; Мордвинцев Владислав Валерьевич – набор пациентов, анкетирование, проведение физикального обследования, обзор литературных данных; Добрынина Ульяна Андреевна – набор пациентов, забор биологического материала для исследования, статистическая обработка данных. Все авторы внесли значимый вклад в исследование и подготовку статьи. Авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.