Особенности иммунных реакций на кратковременное общее охлаждение у практически здоровых жителей г. Архангельска в зависимости от уровней содержания холестерина в крови

ОБОСНОВАНИЕ

Холестерин биосинтезируется всеми клетками организма и преимущественно локализуется на клеточных мембранах, где взаимодействует с соседними липидами, регулируя жесткость, текучесть и проницаемость бислоя. Изменение текучести липидного матрикса плазматической мембраны за счет изменения содержания холестерина и фосфолипидов, изменения температуры тела существенно влияют на мембранные функции клеток. Кроме того, холестерин может связывать многочисленные трансмембранные белки, помогая поддерживать или изменять их конформацию. Холестерин также взаимодействует с многочисленными стероидными транспортными белками, которые облегчают транспортировку холестерина и регулируют его субклеточное распределение. Помимо биосинтеза, диета и последующее поглощение холестерина из крови играют ключевую роль в поддержании гомеостаза холестерина [1]. Гомеостаз холестерина жизненно важен для надлежащих клеточных и системных функций. Нарушенный баланс холестерина лежит в основе не только сердечно-сосудистых заболеваний, но и растущего числа других заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания и рак. Уровень холестерина в клетках отражает динамический баланс между биосинтезом, поглощением, экспортом и этерификацией — процессом, при котором холестерин превращается в нейтральные эфиры холестерина либо для хранения в липидных каплях, либо для секреции в качестве компонентов липопротеинов [2].

Высокий уровень холестерина в крови запускает доимунные процессы макрофагального и моноцитарного фагоцитоза в тканях. Накопление липопротеинов в субэндотелиальном слое запускает сначала врожденный иммунный ответ, в котором участвуют преимущественно моноциты и макрофаги, а затем адаптивный иммунный ответ. Эти воспалительные реакции часто становятся хроническими и могут привести к повреждению артерий и образованию тромбов. Механизмы иммунной реакции, связанные с клеточным холестерином, фенотипической пластичностью, метаболизмом и старением, играют ключевую роль в воздействии на эти реакции [3]. На начальных стадиях накопление липопротеинов усугубляет эндотелиальную дисфункцию, которая характеризуется экспрессией молекул адгезии и проницаемостью эндотелиального слоя. Эти изменения приводят к усилению адгезии, удержанию и миграции иммунных клеток в субэндотелиальное пространство [4].

Высокий уровень холестерина стимулирует синтез цитокинов макрофагами, снижение макрофагального фагоцитоза, экспрессию нуклеотидов для мобилизации нейтрофилов. Активация и пролиферация Т-клеток требуют холестерина для построения мембран и стимулирует дифференцировку клеток, их рост, экспрессию генов путем связывания с различными факторами транскрипции [4]. Высокие уровни холестерина ассоциированы с активизацией клеток CD8+, CD4+, CD17+, секрецией цитокинов Ил-2, Ил-6, Ил-8, Ил-10 и снижением активности естественных киллеров [5]. Во время развития поражения баланс различных подмножеств Т-клеток определяет образование обструктивных бляшек. Клетки Th1 и Th17 являются провоспалительными и проатерогенными, в то время как клетки Th2 секретируют противовоспалительные цитокины, а Treg-клетки подавляют активность CD4+ Th и цитотоксических CD8+ T-клеток и способствуют противовоспалительному фенотипу макрофагов и разрешению воспаления [6].

Известно, что сердечно-сосудистые заболевания чаще обостряются зимой, чем летом. Зимы также связаны с более высокой частотой метаболического синдрома [7]. Зимой люди, независимо от пола, имеют более высокий уровень общего холестерина, ЛПНП, ЛПВП, глюкозы. Температура воздуха, атмосферное давление и относительная влажность оказывают более сильное влияние на изменение липидного профиля, чем фотопериодика [8].

Адаптация к неблагоприятным условиям Арктики, в том числе к воздействию низких температур, требует метаболических изменений. В арктических и северных районах у некоренного населения может сформироваться «северная дислипидемия», проявляющаяся в нарастании атерогенных фракций липидов в крови [9].

Большое значение в повышении устойчивости организма человека к действию экстремальных климатогеографических факторов Севера придается адаптивным метаболическим перестройкам мембран клеток. Гомеовязкостная адаптация мембран к холоду и гипоксии сопровождается накоплением в них липидов и перестройкой фосфолипидов, делающих мембрану более стабильной [10]. С накоплением липидов в мембранах клеток связывают высокий уровень окислительно-восстановительных процессов липопротеинов у жителей Севера [11].

Одним из факторов, обеспечивающих особенности реагирования на холод, является исходный фоновый уровень иммунной системы [12].

Тем не менее научные данные об ответных реакциях на холодовой стресс со стороны иммунной системы остаются неоднозначными.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выявить особенности иммунных реакций у практически здоровых лиц в ответ на кратковременное холодовое воздействие в зависимости от исходного содержания общего холестерина в крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Лаборатория экологической иммунологии Института физиологии природных адаптаций ФИЦКИА УрО РАН.

Время исследования. Февраль 2023 г.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Популяция: женщины в возрасте от 21 года до 50 лет.

Критерии включения: практически здоровые, не имеющие в период обследования острых и обострения хронических заболеваний.

Критерии исключения: уровень общего холестерина выше 5,2 ммоль/л, а также индекс массы тела (ИМТ) ≥25.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

По результатам обследования были сформированы группы лиц по квартилям в зависимости от уровня общего холестерина периферической крови. Первую группу лиц (Q1=27 человек) составляли 25% обследуемых с минимальными уровнями общего холестерина, вторую группу (Q4=27 человек) — 25% с самыми высокими.

Дизайн исследования: интервенционное сравнительное ретроспективное исследование.

Описание медицинского вмешательства (для интервенционных исследований)

Забор крови производился из локтевой вены натощак утром до и сразу после общего охлаждения в повседневной бытовой одежде в течение 5 минут при температуре -25 ºС в воздушной среде в холодильной камере УШЗ-25Н (Ксирон холод, Россия).

Методы

Измеряли артериальное давление, вес, рост, индекс массы тела.

Исследование липидного профиля включало определение общего холестерина, глюкозы, триглицеридов, фосфолипидов, инсулина на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) реактивами фирмы «Вектор-Бест» (Россия).

Комплекс иммунологического исследования включал изучение гемограммы венозной крови, взятой утром натощак (количество тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов, общее содержание гемоглобина в крови, лейкограммы) на автоматическом гематологическом анализаторе XS–500i (Sysmex, Япония); фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов крови определяли по поглощению латексных частиц диаметром 0,9 мкм в мазках, окрашенных по методу Романовского–Гимзе. Цитокины IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10 периферической крови определяли иммуноферментным методом на иммуноферментном анализаторе Multiskan FC (Thermo Scientific, США) реактивами фирмы «Вектор-Бест» (Россия).

Комплекс иммунологического обследования включал фенотипирование лимфоцитов с определением маркеров CD3⁺, CD8⁺, CD4⁺, CD10⁺, CD25⁺, CD95⁺, CD16⁺, CD56⁺, CD54⁺ методом проточной цитометрии на проточном цитометре Epiсs XL (Beckman Coulter, США). Гейтирование лимфоцитов проведено по CD45⁺.

Статистический анализ

Статистическую обработку с определением среднего арифметического и стандартной ошибки (М±m) проводили с использованием пакета программы «Microsoft Excel». Корелляционный анализ проведен с помощью критерия Пирсона. Значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при проведении статистического анализа с применением пакета прикладных программ «Statistica».

Этическая экспертиза

На проведение исследования получено разрешение этической комиссии Института физиологии природных адаптаций ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН (протокол №8 от 30 марта 2022 г). Обследование проводилось с письменного согласия волонтеров врачом медицинской компании «Биолам» (г. Архангельск) с соблюдением норм и правил биомедицинской этики, утвержденных Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатели фонового состояния клинических и биохимических показателей, кровяного давления в обеих группах обследуемых указаны в таблице 1.

Средний возраст обследуемых лиц в группе Q4 был выше (30,57±1,69 в сравнении с 26,57±1,81 года). Это же подтверждается достоверной корреляционной взаимосвязью r=0,275, p<0,05.

Вес, рост, ИМТ, показатели артериального давления и ЧСС обследуемых обеих групп не имели достоверных различий.

В группе лиц Q1 средний уровень глюкозы превышал верхнюю границу нормы у 15,38% обследуемых и в среднем составил 5,25±0,88 ммоль/л. В группе Q4 у 21,43% участников уровни глюкозы в периферической крови превосходили пределы нормы.

Средний уровень триглицеридов периферической крови у 61,54% лиц в группе Q4 превышал верхнюю границу нормы и составил 1,80±0,16 ммоль/л. В группе Q1 лишь у 23,08% уровень триглицеридов был выше референсных значений.

В таблице 2 представлены гематологические показатели периферической крови у лиц обеих исследуемых групп.

В группе лиц с минимальными уровнями общего холестерина не было зарегистрировано ни одного случая дефицита гемоглобина, в то время как у обследованных с более высокими уровнями холестерина чаще регистрировали дефицит гемоглобина в 14,29% случаев, а после кратковременного общего охлаждения — в 21,43%.

Общее число тромбоцитов, а также показатель тромбокрита в группе Q4 был значительно выше (259,07×10^3 кл/мкл и 0,27% соответственно).

Лейкоцитарные показатели периферической крови обследуемых представлены в таблице 3.

Средние уровни лейкоцитов периферической крови, в том числе нейтрофильных гранулоцитов, у обследуемых обеих групп не имели достоверных различий.

Лейкоцитарная формула крови лиц группы Q1 отличалась более высоким содержанием лимфоцитов (2,86±0,49×10^9 кл/л и 47,64±1,84% в сравнении с 2,25±0,22×10^9 кл/л и 39,11±0,94% соответственно, p<0,05).

Группа Q4 отличалась более высокими средними уровнями моноцитов в составе лейкоцитограммы (0,40±0,10×10^9 кл/л и 6,26±1,43% в сравнении с 0,24±0,06×10^9 кл/л и 4,46±1,40%, p<0,05).

Процент активных фагоцитов — как нейтрофилов, так и моноцитов, — периферической крови у лиц из обеих групп практически не отличался. Но интенсивность фагоцитоза моноцитов периферической крови у обследуемых в группе Q4 была несколько выше (7,4±0,44 л.ч./кл по сравнению с 5,33±0,58 л.ч./кл, p<0,05).

После кратковременного общего охлаждения у лиц группы Q1 заметно увеличился средний уровень лейкоцитов (с 5,94±0,78 до 6,69±0,86×10^9 кл/л) в основном за счет сегментоядерных нейтрофилов (с 2,42±0,04 до 3,48±0,07×10^9 кл/л, p<0,05).

Результаты фенотипирования лимфоцитов до и после кратковременного общего охлаждения представлены в таблице 4.

Выявлено, что у лиц из группы Q1 более высокий уровень содержания Т-хелперов (0,68±0,18×10^9 кл/л) и Т-лимфоцитов с рецептором к трансферрину (0,82±0,29 ×10^9 кл/л). После кратковременного общего охлаждения у обследованных лиц значительно снижается содержание Т-хелперов с 0,68±0,18 до 0,42±0,05×10^9 кл/л (с 24,22±3,50 до 16,77±2,13%), цитотоксических Т-лимфоцитов (с 0,56±0,09 до 0,35±0,06×10^9 кл/л), активированных Т-лимфоцитов с рецептором к трансферрину (с 0,82±0,29 до 0,43±0,05×10^9 кл/л) и к Ил-2 (с 0,57±0,09 до 0,35±0,09×10^9 кл/л). В группе Q4 статистически значимых изменений уровней Т-хелперов не происходит.

Уровни цитотоксических лимфоцитов с рецептором CD8+ в обеих группах сравнения находились в пределах физиологической нормы. Однако у лиц в группе Q1 цитотоксические лимфоциты составляли 19,91±0,92%, а у лиц группы Q4 — 26,67±1,00%. Установлена корреляционная взаимосвязь между содержанием лимфоцитов CD8+ и уровнями общего холестерина с коэффициентом r=0,335, p<0,05.

Уровень лимфоцитов c молекулой межклеточной адгезии-1 CD54 у лиц группы обследуемых Q1 более чем в два раза ниже, чем у участников группы Q4 как в относительном (14,67±3,21% против 30±5,29%), так и в абсолютном (0,18±0,03 ×10^9 кл/л против 0,51±0,03×10^9 кл/л) выражениях, p<0,05. Выявлены корреляционные взаимосвязи между уровнем общего холестерина периферической крови и относительным (r=0,582) и абсолютным (r=0,648) уровнями CD54 в составе лимфоцитограммы, p<0,05.

Отмечали двукратное снижение процентного содержания натуральных киллеров CD56 в ответ на кратковременный холодовой стресс у обследуемых группы Q1 (с 16,75±0,48 до 8,33±0,29%).

Уровни В-лимфоцитов с рецептором CD19+ в условиях холодового воздействия у лиц обеих групп не изменяются.

Динамика изменений цитокинового профиля продемонстрирована в таблице 5.

Цитокиновый профиль в группе с максимальными уровнями содержания общего холестерина периферической крови отличался более высокими уровнями IL-1β (7,13 пг/мл) и TNF-α (14,3 пг/мл) по сравнению с группой с минимальными уровнями холестерина.

Необходимо отметить, что после кратковременного холодового стресса в группе Q1 отмечали двукратное увеличение TNF-α с 6,77 до 13,33 пг/мл, а в группе Q4 — резкое снижение IL-1β с 7,13 до 3,44 пг/мл.

ОБСУЖДЕНИЕ

Репрезентативность выборок

Выборка имеет ограничения по полу и возрасту обследуемых, а также по климатогеографическим условиям проживания.

Сопоставление с другими публикациями

Установлено, что фоновые уровни общего холестерина в крови, близкие к верхней границе физиологической нормы, ассоциированы с более высокими уровнями моноцитов в циркуляции. Моноциты и макрофаги являются пулом клеток, состояние которых отражает даже минимальные гомеостатические отклонения, характерные для начальных стадий заболеваний, а их неадекватная реакция на стимулы может иметь самостоятельное значение в патогенезе как основного заболевания, так и его осложнений. Нарушение липидного обмена, повышенные уровни холестерина крови могут быть причиной увеличения содержания моноцитов в крови [13].

Отмеченные нами более высокие фоновые уровни провоспалительных цитокинов у лиц в группе Q4, сохраняющиеся после кратковременного холодового стресса, свидетельствуют об активизации превентивного воспаления. Повышенные уровни IL-1ß и TNF-α усиливают рецепторный аппарат клеток, активируют не только местные, но и системные механизмы регуляции гемодинамики, свертывания крови и фибринолиза, каллекриин-кининовую и простагландиновую системы, систему комплемента и синтез острофазовых белков [14]. IL-1ß способствует накоплению холестерина в стенках артерий. Транспорт молекул IL-1ß в гладкомышечных клетках идет через те же каналы, что и транспорт молекул холестерина. В результате молекулы IL-1ß временно «перекрывают» выход из клетки, заставляя холестерин накапливаться внутри, что приводит к повреждению тканей. Кроме того, IL-1ß блокирует рецепторы к никотиновой кислоте (ниацин). Этот эффект важен в патогенезе атеросклероза, так как ниацин способствует выведению холестерина из гладкомышечных клеток артерий [15].

Высокий уровень холестерина в крови запускает доимунные процессы макрофагального и моноцитарного фагоцитоза в тканях. Системное воспаление любой этиологии сопровождается пролиферацией промоноцитов, последующим увеличением количественного пула моноцитов в периферической крови, а также рекрутированием их в атеросклеротические бляшки [16].

Более высокие фоновые концентрации тромбоцитов у лиц из группы Q4 с уровнями общего холестерина в крови, близкими к верхней границе референсных значений, могут являться одним из показателей нарушения метаболизма [17]. Метаболические нарушения связаны с активизацией воспаления, повреждений тканей, гипоксией и усилением лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии. Повышение CD54+ может быть связано с ростом адгезии лейкоцитов и тромбоцитов к эндотелию сосудов, что повышает риск развития атеросклеротических изменений и сердечно-сосудистых нарушений у лиц в группе Q4 [18].

В ответ на острый холодовой стресс у лиц из группы Q1 с минимальными уровнями общего холестерина периферической крови выявлено снижение лимфоцитов с маркерами CD4+, CD8+, CD25+, CD71+, CD56+ в 1,3–1,6 раза. У лиц группы Q4 с концентрацией холестерина, близкой к физиологическим пределам, после общего кратковременного охлаждения уровни изучаемых фенотипов лимфоцитов не изменяются, за исключением снижения цитотоксических лимфоцитов с маркером CD8+.

В ранее проведенных нами исследованиях показано, что реакция иммунной системы может проявляться разнонаправленными изменениями уровня лимфоцитов периферической крови. Фоновый уровень иммунной системы является одним из факторов, обеспечивающих особенности ответной реакции на холодовой стресс. Миграция лимфоцитов происходит за счет активированных Т-лимфоцитов, способных к бласттрансформации и дифференцировке [12][19].

Ограничения исследования

Основным ограничением было небольшое количество обследуемых взрослых женщин, проживающих в г. Архангельске.

Направления дальнейших исследований

Планируется продолжение исследований липидного профиля у практически здоровых лиц с целью установления механизмов адаптации к неблагоприятным условиям Арктики, а также сравнение данных с результатами обследования мужчин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, иммунологический фон у обследуемых группы Q4 с уровнями холестерина, близкими к верхней границе нормы, находится в более напряженном состоянии за счет реакций со стороны моноцитов и лимфоцитов периферической крови, более высоких уровней провоспалительных цитокинов. Молекулы адгезии повышают эффективность клеточных контактов, в том числе реакцию со стороны тромбоцитов. У 14,29% участников с уровнями холестерина, близкими к верхней границе нормы, регистрировали дефицит гемоглобина периферической крови, а после кратковременного холодового воздействия — у 21,34%. Ответная иммунная реакция на кратковременное общее холодовое воздействие более выражена у лиц группы Q1 с минимальными уровнями холестерина и проявляется в снижении содержания клеток CD4+, CD8+, CD25+, CD71+, CD56+ в 1,3-1,6 раза.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Выполнено в рамках госзадания №122011300377-5.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Штаборов В.А. — существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, написание статьи; Патракеева В.П. — существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи; Алесич Р.С. — существенный вклад в получение, анализ данных и интерпретацию результатов, внесение в рукопись существенной правки с целью повышения научной ценности статьи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.