Генетические предикторы хронической сердечной недостаточности у больных ожирением

ОБОСНОВАНИЕ

Ожирение – огромная медицинская, социальная и экономическая проблема, затрагивающая большинство стран мира, включая Россию [1, 2].

Ожирение характеризуется рядом структурных изменений сердца – расширением границ сердца, увеличением массы и концентрической гипертрофией миокарда левого желудочка, гипертрофией и дилатацией правого желудочка, дилатацией предсердий. Эти изменения в ряде случаев предшествуют развитию хронической сердечной недостаточности с сохраненной систолической функцией левого желудочка (ЛЖ), которую также называют диастолической сердечной недостаточностью (ДСН). Присоединение ДСН вызывает у больных ожирением еще большее снижение толерантности к физической нагрузке, гиподинамию, задержку жидкости, нарушения метаболических процессов и в итоге приводит к прогрессированию самого ожирения [3].

В то же время очевидно, что далеко не у всех больных ожирением формируется клинически манифестная ДСН. В реализации влияния ожирения на морфофункциональное состояние сердца может иметь значение и генетический фактор.

Ведущей концепцией развития сердечной недостаточности является избыточная активация нейрогормональных систем, прежде всего ренин-ангиотензин-альдостероновой (РААС) и симпато-адреналовой [4]. Важную роль в патогенезе фиброза и апоптоза миокарда напрямую или через каскад сигнальных посредников играют ангиотензин II (АТII), ренин и альдостерон. Так, АТII, образующийся в миокарде под влиянием тканевой РААС, повышает проницаемость эндотелия коронарных артерий, облегчая диффузию ростовых факторов к месту их действия, регулирует процессы апоптоза, активирует митогены и факторы роста, участвующие в процессах ремоделирования сердца, стимулирует продукцию цитокинов и других нейрогормонов (альдостерона, вазопрессина, эндотелина) [5].

Не меньшее значение в регуляции тканевых процессов миокарда имеет альдостерон, гиперактивация которого лежит в основе двух главных патогенетических паттернов. Во-первых, это один из механизмов атерогенеза – за счет развития дисфункции эндотелия, снижения биодоступности оксида азота, системного воспаления, гиперкоагуляции (стимуляция ингибитора активатора плазминогена) [6]. Во-вторых, механизм прогрессирующего фиброза миокарда (снижение плазменного уровня N-концевого пептида коллагена III типа, активации профибротического цитокина TGF-beta) и формирования ригидной стенки ЛЖ с другой. Такое сочетание нарушенного кровоснабжения миокарда и процессов фиброза миокардиального матрикса является основой для развития патологического ремоделирования сердца с исходом в хроническую сердечную недостаточность (ХСН).

Известно, что в геноме человека выявляются многочисленные полиморфные варианты ДНК, при которых у разных людей в определенном положении находятся разные нуклеотиды. Данные изменения также являются мутациями, однако поскольку они расположены в участках, не кодирующих белки, либо не нарушают аминокислотную структуру белков, их принято называть однонуклеотидными полиморфизмами, или SNP. На сегодняшний день в геноме человека обнаружено более 1 млн SNP. SNP могут изменять регуляторные участки генов, таким образом определяя количество соответствующего белка, или могут оказаться сцепленными с другими функционально значимыми мутациями, которые пока неизвестны. Для определения молекулярно-генетических факторов, которые, в свою очередь, будут определять вклад в то или иное мультифакториальное заболевание, анализируют SNP, расположенные внутри или вблизи генов с наибольшим вкладом в патогенез заболевания.

Знание роли генетических факторов в развитии и прогрессировании ХСН позволяет по-новому взглянуть на вопросы этиологии и патогенеза, оценить перспективы и эффективность лечения данного заболевания и в итоге обеспечить улучшение качества жизни и выживаемость данной категории больных [7, 8].

На сегодняшний день можно выделить группы так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие ХСН [9–11]. Анализ ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное клиническое значение в лечении данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента.

На основании вышеизложенного становится очевидным, что изучение генетических маркеров и их значения в формировании сердечной недостаточности при ожирении является актуальной проблемой современной медицины, решение которой позволит осуществлять эффективную профилактику сердечно-сосудистых осложнений, оптимизировать лечение и улучшить прогноз пациентов с ожирением.

ЦЕЛЬ

Поиск генетических маркеров, предположительно вовлеченных в патогенез вторичной ДСН у больных ожирением.

МЕТОДЫ

Исследование проведено в клинике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии». Для генетического исследования были отобраны образцы биоматериалов (цельная кровь) 104 больных ожирением, русских, проживающих на территории г. Москвы.

Критерии включения больных в исследование.

1. Для всех больных – индекс массы тела более 45 кг/м2.
2. Для больных, включенных в группу с ДСН:
   • наличие клинических признаков ДСН II–III функционального класса по классификации New York Heart Association (одышка при физической нагрузке, результаты теста с 6-МХ менее 550 м, ортопноэ или сухой кашель в горизонтальном положении тела или застойные влажные хрипы в нижних отделах легких);
   • нормальная систолическая функция ЛЖ по данным эхоКГ (фракция выброса (ФВ) ЛЖ более 45–50%, ДS 20–35%, индекс конечного диастолического объема (КДО) ЛЖ меньше 102 мл/м2);
   • признаки диастолической дисфункции ЛЖ по I типу (отношение пиков Е/А менее 1,0, время изоволюмического сокращения (ВИВР) ЛЖ более 100 мс, время замедления раннего диастолического наполнения (ВЗЕ) более 200 мс) или по II типу (Е/А более 1,6, ВИВР ЛЖ менее 80 мс, ВЗЕ менее 150 мс);
   • уровень N-концевого предшественника мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) в сыворотке крови более 400 пг/мл.

Пациентам проводили комплекс антропометрических измерений и вычисляли индекс массы тела (ИМТ). Оценивали выраженность сердечной недостаточности (СН) по шкале оценки клинического статуса (ШОКС). Всем больным были проведены ЭКГ, трансторакальная эхокардиография (эхоКГ), проба с 6-минутной ходьбой (6-МХ) и определялось содержание NT-proBNP в плазме крови.

Уровень NT-proBNP измеряли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA – enzim-linked immunosorbentassay). Для учета результатов и построения калибровочной кривой использовался вертикальный спектрофотометр Sunrise фирмы «TECAN» (Австрия) с прилагаемым программным обеспечением. Тест-система позволяет определять концентрацию NT-proBNP в сыворотке и в гепаринизированной плазме. Исходили из того, что при уровне >125 пг/мл СН вполне вероятна, что отражает наличие или развитие нарушений насосной функции сердца.

Диагноз ожирения ставили на основании значения ИМТ. Диагноз ДСН выставляли в случае сочетания клинических симптомов СН, признаков диастолической дисфункции миокарда ЛЖ по данным эхоКГ и повышения уровня NT-proBNP в плазме крови, что отражено в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика исследуемых групп больных

В соответствии с критериями отбора были сформированы 2 группы больных: 1 группа – ожирение III степени (О III) – 50 пациентов с ожирением без ДСН («ДСН-»); 2 группа – ожирение III степени + ДСН (О III + ДСН) – 54 пациента с ожирением в сочетании с ДСН («ДСН+»).

Геномную ДНК пациентов использовали для амплификации фрагментов ДНК, содержащих полиморфные маркеры генов-кандидатов, предположительно вовлеченных в патогенез СН при ожирении.

Анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov). Использовали следующие разделы: MapView (построение генетической карты), dbSNP (информация о полиморфных маркерах). Для подбора праймеров и рестриктаз использовали пакет программ InvitrogenVector NTI Advance 10 (версия Education).

Анализировались следующие гены-кандидаты:

• ген ангиотензиногена AGT, выявление мутации C521T и T704C;
• ген рецептора ангиотензина II первого типа (AGTR1), выявление мутации A1166C (регуляторная область гена);
• ген рецептора ангиотензина II второго типа (AGTR2), выявление мутации G1675A (регуляторная область гена);
• ген альдостеронсинтазы (CYP11B2), выявление мутации C(-344)T (регуляторная область гена).

Ген AGT кодирует белок ангиотензиноген, сывороточный глобулин, вырабатываемый клетками печени, из которого под действием ренина образуется ангиотензин I. Участок ДНК гена AGT, в котором происходит замена цитозина (С) на тимин (Т) в позиции 521, называется генетическим маркером C521T. В результате такой замены в белке ангиотензиногене в позиции 174 аминокислотной последовательности аминокислота триптофан замещается на метионин (Thr174Met). Возможные генотипы: С/С, С/Т, Т/Т.

Частота встречаемости Т-аллеля в европейской популяции составляет 10–15% [8, 12]. Ген AGT кодирует белок ангиотензиноген – сывороточный глобулин альфа-глобулиновой фракции, вырабатываемый в основном клетками печени, из которого под действием ренина образуется ангиотензин I. Существует около 15 различных аллельных вариантов гена AGT. Наибольшая ассоциация с развитием гипертонии показана для замены цитозина (С) на тимин (Т) в позиции 521 последовательности ДНК гена AGT. Данный участок называется генетическим маркером C521T. В результате такой замены в белке ангиотензиногене в позиции 174 аминокислотной последовательности происходит замещение аминокислоты триптофана на метионин (Thr174Met). Генотип С/С встречается у 83%, С/Т – у 14%, Т/Т – у 3% населения России. При исследовании распределения генотипов в группе пациентов старше 45 лет с артериальной гипертонией выявлено увеличение частоты встречаемости генотипа С/Т примерно в 5 раз по сравнению с контрольной группой, не имеющей в анамнезе сердечно-сосудистых патологий. Также наличие в генотипе аллеля Т существенно повышает риск развития ишемической болезни сердца [13].

Участок ДНК гена AGT, в котором тимин (Т) заменяется на цитозин (С) в позиции 704, называется генетическим маркером T704C. В результате такой замены в белке ангиотензиногене в позиции 235 аминокислотной последовательности происходит замещение аминокислоты метионина на триптофан (Met235Thr). Возможные генотипы: Т/Т, Т/С, С/С.

Частота встречаемости С-аллеля в европейской популяции составляет 41%, он наиболее распространен в африканской популяции (87%). Из-за этого у людей с генотипом С/С в плазме увеличивается концентрация ангиотензиногена на 10-20% по сравнению с генотипом Т/Т [14].

Ген AGTR1 кодирует белок-рецептор к ангиотензину II 1-го типа. Участок в регуляторной области последовательности ДНК гена AGTR1, в котором аденин (А) заменяется на цитозин (С) в позиции 1166, называется генетическим маркером А1166С. В результате такой замены изменяется характер регуляции экспрессии гена. Возможные генотипы: А/А, А/С, С/С.

Частота встречаемости С-аллеля в европейской популяции составляет 27%. Ангиотензин II взаимодействует с двумя клеточными рецепторами ангиотензина 1-го и 2-го типов, кодируемых соответственно генами AGTR1 и AGTR2. Рецепторы 1-го типа в большей степени отвечают за реакцию сердечно-сосудистой системы на действие ангиотензина II. Многочисленные исследования показали, что частота генотипов А/С и С/С по маркеру А1166С гена AGTR1 достоверно выше в группах пациентов, страдающих гипертонией, чем в контрольной группе здоровых людей. Причиной усиления экспрессии гена AGTR1 в результате замены аденина (А) на цитозин (С) в позиции 1166 в регуляторной области является изменение характера регуляции трансляции гена с помощью микроРНК miR155 [14]. МикроРНК представляют собой некодирующие молекулы РНК, регулирующие экспрессию генов путем комплементарного связывания с нетранслируемыми участками мРНК-мишени. МикроРНК miR155 негативно регулирует экспрессию гена AGTR1, но связываться она может только с мРНК, синтезируемой с аллеля А, поэтому при замене основания А на С нарушается регуляция трансляции и белка синтезируется больше. Это и является причиной ассоциации аллеля С с артериальной гипертензией [15].

Ген AGTR2 кодирует белок-рецептор к ангиотензину II 2-го типа. Участок в регуляторной области последовательности ДНК гена AGTR2, в котором гуанин (G) заменяется на аденин (А) в позиции 1675, называется генетическим маркером G1675A. В результате такого замещения меняется характер регуляции экспрессии гена. Возможные генотипы: G/G, G/A, А/А.

Частота встречаемости аллеля A в европейской популяции составляет 56% [16]. Сердечно-сосудистые эффекты ангиотензина II, опосредованные АТ2-рецепторами, противоположны эффектам, обусловленным АТ1-рецепторами. То есть под действием ангиотензина II АТ1 рецепторы отвечают за повышение кровяного давления, а рецепторы АТ2 – за его снижение. Наибольшее количество АТ2-рецепторов обнаружено в тканях плода, в постнатальном периоде их количество снижается. У взрослых они экспрессируются в основном в клетках сердца, сосудов, надпочечников, почек, репродуктивных органов. Данные рецепторы также участвуют в регуляции программированной клеточной гибели (апоптозе), процессах пролиферации и дифференцировки клеток и играют важную роль в развитии организма и его патофизиологии [17].

Участок в регуляторной области последовательности ДНК гена AGTR2, в котором гуанин (G) заменяется на аденин (А) в позиции 1675, называется генетическим маркером G1675A. В результате такого замещения меняется характер регуляции экспрессии гена. Аллель G ассоциирован с активацией транскрипции и увеличением на поверхности клетки количества рецепторов ангиотензина II 2-го типа.

При изучении ассоциации полиморфизма гена AGTR2 по маркеру G1675А было выявлено увеличение чувствительности к ангиотензину II у носителей аллеля A. Генотипы А/А и G/A ассоциированы с повышением риска гипертонии, а также с осложнениями беременности и ишемической болезнью сердца.

Поскольку ген AGTR2 расположен на Х-хромосоме, частоты распределения генотипов сильно зависят от пола.

Ген CYP11B2 кодирует второй полипептид цитохрома Р450 семейства 11 подсемейства B (cytochromeP450, subfamilyXIB, polypeptide 2; CYP11B2), альтернативное название – альдостеронсинтаза (англ. aldosteronesynthase), катализирует последнюю стадию синтеза гормона альдостерона из дезоксикортикостерона. Участок ДНК в регуляторной области гена CYP11B2, в которой происходит замена цитозина (С) в позиции -344 на тимин (Т), обозначается как генетический маркер C(-344)T. Возможные генотипы: С/С, С/Т, Т/Т. Частота встречаемости в популяции: аллель С встречается у русских с частотой 45%.

Известно несколько однонуклеотидных полиморфизмов в гене альдостеронсинтазы. Наиболее полно исследован полиморфизм, проявляющийся в замене цитозина на тимин в -344-м положении нуклеотидной последовательности, в регуляторной области гена. Этот участок является сайтом связывания стероидогенного фактора транскрипции SF-1, регулятора экспрессии гена альдостеронсинтазы. Согласно последним исследованиям, аллель Т приводит к усилению продукции альдостерона, что, в свою очередь, связано с артериальной гипертонией, а также фиброзом и гипертрофией миокарда и риском гипертензивных осложнений беременности [18]. Кроме того, гиперпродукция альдостерона способствует усилению экспрессии ингибитора активатора плазминогена-1, что влечет за собой развитие эндотелиальной дисфункции – причины кардиоваскулярных осложнений у пациентов с хронической болезнью почек [19].

Статистическая обработка проводилась с помощью программного обеспечения пакета Statistica 10,0 с использованием описательной статистики, непараметрических методов анализа (Mann-Whitney U, Wilcoxon), рангового корреляционного анализа (Spearman), однофакторного дисперсионного анализа.

Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов использовали метод χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность, при этом прибегали к построению «сетки 3х2». Распределение аллелей и генотипов соответствовало закону Харди-Вайнберга. Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR). Как положительную ассоциацию ("предрасположенность") аллеля или генотипа с заболеванием считали OR>1, как отрицательную – OR<1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты анализа частоты распределения частот аллелей и генотипов генов-регуляторов РААС у мужчин с ожирением и ДСН представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов-регуляторов РААС у мужчин с ожирением и ДСН. Мультипликативная модель наследования (тест хи-квадрат, df=1)

Было установлено, что у мужчин с ожирением и ДСН достоверно чаще встречается аллель ТC521T гена AGT 521(C>T), кодирующий синтез и активность ангиотензиногена. При сравнении групп «ДСН+» и «ДСН-» по распределению частот генотипов оказалось, что в первой группе достоверно чаще преобладал генотип Т/Т (р=0,039). При этом относительный риск (ОР) развития заболевания при данном генотипе повышен более чем в 4 раза (ОР=4,26, 95% доверительный интервал (ДИ) 0,16–116,34).

Важным результатом является то, что достоверные различия между группами были получены и в распределении аллелей и генотипов гена альдостеронсинтазы – CYP11B2.

Было установлено, что у мужчин с ожирением и ДСН достоверно чаще встречается аллель Т гена CYP11B2 -344_C>T, кодирующего синтез и активность альдостеронсинтазы. При сравнении групп «ДСН+» и «ДСН-» по распределению частот генотипов показано, что в первой группе достоверно чаще преобладал генотип Т/Т (р=0,008). При этом ОР развития заболевания при данном генотипе повышен в 5,93 раза (ОР=5,93, 95% ДИ 0,32–11,74). Эти данные свидетельствует о том, что полиморфные маркеры C521T гена AGT и С-344Т гена CYP11B2 ассоциированы с развитием ДСН у мужчин, страдающих ожирением.

Анализ частот распределения генов рецепторов к ангиотензину II 1-го типа (AGTR1_1166_A>C) и 2-го типа (AGTR2_1675_G>A) показал отсутствие различий между сравниваемыми группами больных.

Результаты анализа частоты распределения частот аллелей и генотипов генов-регуляторов РААС у женщин с ожирением и ДСН представлены в таблице 3.

Таблица 3 Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов-кандидатов у женщин с ожирением и ДСН. Мультипликативная модель наследования (тест хи-квадрат, df=1)

Как видно из представленных данных, у женщин с ожирением и ДСН достоверно чаще встречается аллель Т гена альдостеронсинтазы CYP11B2. При сравнении групп «ДСН+» и «ДСН-» по распределению частот генотипов было показано, что в первой группе достоверно чаще преобладал генотип Т/Т (р=0,014); относительный риск развития ДСН при данном генотипе повышен в 4,57 раза (ОР=5,93, 95% ДИ 0,24–10,09). Данных за ассоциацию всех остальных генетических маркеров у женщин с ДСН получено не было.

Таким образом, исследование генетических маркеров РААС у больных с ожирением свидетельствует в пользу того, что развитие ДСН ассоциировано у обоих полов с генетической мутацией гена альдостеронсинтазы CYP11B2, а именно с заменой аллеля С в положении -344 на аллель Т. У мужчин развитие ДСН ассоциировано, кроме того, с генетической мутацией гена ангиотензиногена AGT, а именно с заменой аллеля С в положении 521 на аллель T гена 521.

ОБСУЖДЕНИЕ

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы.

1. Развитие вторичной ДСН у лиц с ожирением обоих полов ассоциируется с мутацией гена альдостеронсинтазы CYP11B2, а именно с заменой аллеля С в положении -344 на аллель Т и наличием генотипа Т/Т, что подтверждает данные о значении гиперальдостеронизма в патогенезе заболевания. Относительный риск развития заболевания при генотипе Т/Т повышен в 5,93 раза у мужчин (р=0,008) и в 4,57 раза у женщин (р=0,014).
2. Для мужчин имеет значение мутация гена ангиотензиногена AGT, а именно замена аллеля C в положении 521 на аллель T. При этом относительный риск развития ДСН при генотипе Т/Т повышен в 4,26 раза (р=0,039).
3. Мутации генов рецептора ангиотензина II первого типа AGTR1 (A1166C) и рецептора ангиотензина II второго типа AGTR2 (G1675A) не ассоциированы с развитием ДСН у больных ожирением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные данные могут быть использованы при стратификации риска развития вторичной сердечной недостаточности у лиц с ожирением.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ.

Источник финансирования. Федеральный бюджет, государственное задание – тема НИР ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» 0529-2016-0043: «Исследование пищевого статуса и разработка диетотерапии больных, перенесших трансплантацию сердца».

Конфликт интересов. Отсутствует

Благодарности. Директору ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Никитюку Д.Б., научному руководителю ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Тутельяну В.А. за помощь в организации исследования.