Ассоциация однонуклеотидных вариантов генов TCF7L2, FABP2, FTO, DRD2, MC4R с морбидным ожирением у женщин

Обоснование

Ожирение — широко распространенное заболевание, ассоциированное с серьезными осложнениями, повышающее риск развития ишемической болезни сердца, сахарного диабета второго типа (СД2), артериальной гипертензии и почечной недостаточности [1–3]. Ожирение, в первую очередь морбидное, ассоциировано с тяжелым течением и смертностью при гриппе и COVID-19 [4]. Морбидное ожирение — это ожирение с индексом массы тела (ИМТ)≥35 кг/м² при наличии серьезных осложнений, связанных с ожирением или ожирение с ИМТ≥40 кг/м² вне зависимости от осложнений [5]. Морбидное ожирение чаще встречается у женщин, и в возрастном диапазоне 40–59 лет [1].

По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации, на 2019 г. насчитывалось 2,3 миллиона, или 1,9% жителей страны с диагностированным ожирением. Среди регионов России наиболее остро проблема ожирения стоит в Алтайском крае, в котором у 5,8% жителей выявлено ожирение, Магаданской (3,5%) и Курганской (3,1%) областях [6].

Исследования семей и близнецов показали, что вклад генетических факторов в патогенез ожирения составляет около 40–70% [50]. Ожирение с точки зрения генетики можно разделить на моногенное ожирение (мутации в генах, кодирующих участников лептин-меланокортинового пути — AGRP, PYY, MC4R), синдромальное ожирение (вследствие аномалий органов и систем организма, в том числе нервной системы), полигенное ожирение [7].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования является поиск и изучение ассоциации вариантов нуклеотидной последовательности rs9939609 гена FTO, rs7903146 гена TCF7L2, rs1799883 гена FABP2, rs1800497 гена DRD2, rs17782313 гена MC4R с морбидным ожирением у женщин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования — случай-контроль. Группа морбидного ожирения и контрольная группа сформированы из банка ДНК участниц международного проекта Health, Alcohol and Psychosocial factors In Eastern Europe (HAPIEE). В группу морбидного ожирения включали женщин с ИМТ более 40 кг/м², в контрольную группу с нормальным ИМТ.

Методы

Генотипирование выполнено методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) в 5% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (EtBr) (rs1799883 гена FABP2, rs1800497 гена DRD2, rs17782313 гена MC4R) и ПЦР в режиме реального времени (rs9939609 гена FTO, rs7903146 гена TCF7L2) с использованием TaqMan зондов (Applied Biosystems, США).

Для генотипирования по rs1799883 гена FABP2 использовали праймеры: 5’- ACAGGTGTTAATATAGTGAAAAG-3’(F) и 5’-TACCCTGAGTTCAGTTCCGTC-3’(R). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл включала: Трис-HCI (pH 9,0) 75 мM, (NH₄)₂SO₄ 20 мM, Тween-20 0,01%, 2,5 мМ MgCl₂, по 0,8 мМ каждого праймера, 0,2 мМ смеси dNTP, 2 мкг ДНК, 1 единицу активности ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 33 цикла, включающих денатурацию 95 °С 30 секунд, отжиг праймеров 56 °С 30 секунд и элонгацию 72 °С 30 секунд. Рестрикцию проводили с 10 единицами активности рестриктазы AspleI («СибЭнзим», Новосибирск). Размер продукта амплификации 180 п.н. После проведения рестрикции при генотипе AA детектировался продукт 180 п.н., при GG генотипе — продукты 99 п.н. и 81 п.н., при гетерозиготном генотипе AG все перечисленные продукты: 180 п.н., 99 п.н., 81 п.н.

Для генотипирования по rs17782313 гена MC4R использовали праймеры: 5-AAGCAGGAGAGATTGTATCT-3’(F) и 5-GCTGAGACAGGTTCATAAAA -3’(R). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл включала: Трис-HCI (pH 9,0) 75 мM, (NH₄)₂SO₄ 20 мM, Тween-20 0,01%, 2,5 мМ MgCl₂, по 0,6 мМ каждого праймера, 0,2 мМ смеси dNTP, 2 мкг ДНК, 1 единицу активности ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 35 циклов, включающих денатурацию 95 °С 30 секунд, отжиг праймеров 60 °С 30 секунд и элонгацию 72 °С 30 секунд. Рестрикцию проводили с 10 единицами активности рестриктазы TaqI («СибЭнзим», Новосибирск). Размер продукта амплификации 208 п.н. После проведения рестрикции при генотипе ТТ детектировался продукт 208 п.н., при СС генотипе — продукты 187 п.н. и 21 п.н., при гетерозиготном генотипе ТС все перечисленные продукты: 208 п.н., 187 п.н., 21 п.н.

Для генотипирования по rs1800497 гена DRD2 использовали праймеры: 5’- CCTTCCTGAGTGTCATCAAC-3’(F) и 5’-ACGGCTCCTTGCCCTCTAG-3’(R). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл включала: Трис-HCI (pH 9,0) 75 мM, (NH₄)₂SO₄ 20 мM, Тween-20 0,01%, 2,5 мМ MgCl₂, по 0,8 мМ каждого праймера, 0,2 мМ смеси dNTP, 2 мкг ДНК, 1 единицу активности ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 29 циклов, включающих денатурацию 95 ⁰С 30 секунд, отжиг праймеров 59 ⁰С 30 секунд и элонгацию 72 ⁰С 30 секунд. Рестрикцию проводили с 10 единицами активности рестриктазы TaqI («СибЭнзим», Новосибирск). После проведения рестрикции при генотипе TT детектировался продукт 237 п.н., при CC генотипе — продукты 125 п.н. и 112 п.н., при гетерозиготном генотипе CT все перечисленные продукты: 237 п.н., 125 п.н., 112 п.н [8].

Проверка корректности работы методик ПЦР-ПДРФ проведена с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Статистический анализ

Статистическая обработка полученных результатов осуществлена в программном обеспечении SPSS. Полученные результаты генотипирования статистически обработаны с использованием критерия χ² оценено соответствие частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга в контрольной группе. Сравнение групп по частотам генотипов и аллелей, отношение шансов по конкретному аллелю или генотипу вычислены с помощью таблиц сопряженности с использованием критерия χ² по Пирсону, точного двустороннего критерия Фишера с поправкой Йетса на непрерывность. В качестве уровня значимости использован p<0,05. Дополнительно проведен анализ ассоциаций молекулярно-генетических маркеров с морбидным ожирением с использованием бинарной логистической регрессии. В качестве зависимой переменной взято наличие/отсутствие морбидного ожирения, в то время как независимыми переменными являлись генотип, возраст, нарушения углеводного обмена (по критериям ВОЗ), СД в анамнезе (факт упоминания диагноза СД врачом по данным анкетирования). Полученная Exp (B) интерпретируется как отношение шансов и 95% доверительный интервал для Exp (B).

Этическая экспертиза

Проект HAPIEE одобрен этическим комитетом НИИ терапии СО РАМН (протокол №1 от 14.03.2001). Все обследованные давали информированное согласие на участие в исследовании.

Результаты

Группу морбидного ожирения составили 192 женщины (средний возраст 57,02±7,16 года) с ИМТ более 40 кг/м², контрольную группу — 450 женщин (средний возраст 55,44±7,41 года) с нормальным ИМТ. ИМТ рассчитывался по формуле: масса тела в килограммах, деленная на квадрат роста в метрах, кг/м² [5]. Средний ИМТ в группе морбидного ожирения составил 44,1±3,8 кг/м² (минимальный ИМТ — 40 кг/м², максимальный ИМТ — 60,26 кг/м²). Средний ИМТ в контрольной группе — 23,2 кг/м² (минимальный ИМТ — 20,02 кг/м², максимальный ИМТ — 24,99 кг/м²). У 43 человек из контрольной группы (9,6%) и 85 человек в группе морбидного нарушения (44,3%) выявлены нарушения углеводного обмена. Согласно данным опросника врач говорил о диагнозе СД 9 женщинам (2%) из группы контроля и 27 женщинам из группы морбидного ожирения (14,1%).

Частоты генотипов вариантов rs7903146 гена TCF7L2, rs1799883 гена FABP2, rs9939609 гена FTO, rs1800497 гена DRD2, rs17782313 гена MC4R находятся в равновесии Харди-Вайнберга в контрольной группе (χ²=1,07; 0,03; 1,21; 0,24; 0,004).

Не выявлено статистически значимых различий между группой морбидного ожирения и контрольной группой по частотам генотипов и аллелей однонуклеотидных вариантов rs7903146 гена TCF7L2, rs1799883 гена FABP2, rs1800497 гена DRD2 (р>0,05) (рис. 1–3).

Найдены статистически значимые различия между группами по частотам генотипов вариантов rs9939609 гена FTO (р=0,015) и rs17782313 гена MC4R (р=0,001).

В группе морбидного ожирения доля носительниц генотипа ТТ варианта rs9939609 гена FTO статистически значимо меньше, а генотипа АТ значимо больше, чем в контрольной группе (ОШ=0,579, 95%ДИ 0,399–0,840, p=0,004; ОШ=1,408, 95%ДИ 1,003–1,976, p=0,047 соответственно) (рис. 4). Отношение шансов обнаружить носителя аллеля A в группе морбидного ожирения (46,6%) в 1,366 раза больше по сравнению с контрольной группой (39,0%) (95%ДИ 1,073–1,738, р=0,013),

Гетерозиготный генотип ТС варианта rs17782313 гена MC4R встречается статистически значимо чаще (ОШ=1,825, 95%ДИ 1,257–2,652, р=0,002), а гомозиготный генотип ТТ — реже (ОШ=0,500, 95%ДИ 0,346–0,723, р<0,001) в группе морбидного ожирения по сравнению с контрольной группой (рис. 5). Отношение шансов обнаружить носителя аллеля С в группе морбидного ожирения (28,9%) в 1,72 раза больше по сравнению с контрольной группой (19,1%) (95%ДИ 1,278–2,316, р=0,0004),

По данным регрессионного анализа статистически значимая ассоциация генотипов вариантов rs9939609 гена FTO и rs17782313 гена MC4R с морбидным ожирением не зависит от включения в модель дополнительных категориальных переменных (нарушения углеводного обмена, СД в анамнезе).

Обсуждение

По данным литературы, на олигогенное/моногенное ожирение приходится около 2–3% от всех случаев ожирения. Мультифакторное полигенное ожирение — наиболее распространенная форма данного состояния. Согласно результатам поискового исследования Vettori A, et al. известно 44 генетических локуса, которые ассоциированы с полигенным ожирением [9]. Целью данного исследования стала проверка ассоциации с морбидным ожирением у женщин из популяции г. Новосибирска некоторых из известных молекулярно-генетических маркеров ожирения. Морбидное ожирение более распространенно у женщин, чем у мужчин, поэтому объектом исследования стали женщины. Группа контроля статистически значимо не отличается по возрасту от группы морбидного ожирения. Полученные частоты генотипов в контрольной группе исследуемых однонуклеотидных вариантов соответствуют ожидаемым согласно равновесию Харди-Вайнберга.

Ген TCF7L2 (transcription factor 7 like 2, 10q25.2-q25.3) кодирует транскрипционный фактор, играющий ключевую роль в Wnt-сигнальном пути. Белок вовлечен в поддержание гомеостаза глюкозы крови [10]. Однонуклеотидный вариант rs7903146 (g.53341C>T), локализованный в интроне гена TCF7L2, ассоциирован с риском СД2 как в российских, так и в зарубежных исследованиях [11–55]. Также вариант ассоциирован с риском развития ожирения [15–56]. В исследовании, выполненном в Тюмени, показана ассоциация генотипа ТТ варианта rs7903146 гена TCF7L2 с избыточной массой тела с детского и/или подросткового возраста у женщин. Исследование проведено у женщин в возрастном диапазоне 18–45 лет, в группу ожирения включены женщины с ИМТ более 30 кг/м² [18]. В Новосибирске для мужчин идентифицирован генотип СС полиморфизма в качестве протективного в отношении ожирения (ИМТ 25–30 кг/м²) в возрастной группе 25–35 лет [19]. В Китае найдена ассоциация варианта с ожирением на фоне СД2 [55]. В небольшом исследовании в Камеруне не обнаружили ассоциации варианта rs7903146 гена TCF7L2 с ожирением [20].

Ген FABP2 (fatty acid binding protein 2, 4q26) кодирует внутриклеточный белок, который участвует в транспорте и внутриклеточном метаболизме длинноцепочечных жирных кислот, а также процессах клеточного роста и пролиферации [21]. Однонуклеотидный вариант rs1799883 (c.163A>G) гена FABP2 — миссенс-вариант, приводящий к замене аминокислоты триптофан на аланин в 55 позиции аминокислотной последовательности белка (p.Thr55Ala). Данные по ассоциации варианта с заболеваниями противоречивы. Полиморфизм rs1799883 гена FABP2 ассоциирован с риском СД2 по результатам исследования в республике Татарстан и не ассоциирован с ним по данным исследования в Новосибирске [13][22]. Подобные различия могут быть обусловлены этническими генетическими особенностями, так как, например, в одном из метаанализов показано, что вариант rs1799883 гена FABP2 является маркером СД2 для азиатов, но не для европейцев [23]. У мужчин — жителей Кузбасса не найдена ассоциация варианта rs1799883 гена FABP2 с ожирением (в исследовании в группу ожирения включали мужчин с ИМТ более 30 кг/м²) [24]. В Якутии, наоборот, показана ассоциация гетерозиготного генотипа AG с ожирением [26]. В Китае показана ассоциация генотипов варианта rs1799883 гена FABP2 с ожирением и метаболическим синдромом, но не с СД2. Метаанализ этих же исследователей показал, что вариант ассоциирован с СД2, метаболическим синдромом, но не ожирением [27]. Таким образом, однозначных данных по ассоциации исследуемого варианта с заболеваниями нет.

Ген DRD2 (dopamine receptor D2, 11q23.2) кодирует Д2 подтип дофаминового рецептора. Миссенс-мутации гена DRD2 вызывают миоклоническую дистонию, некоторые варианты гена ассоциированы с развитием шизофрении [28]. Однонуклеотидный вариант rs1800497 (TaqI) расположен в 3’-нетранслируемой области гена DRD2, позже был отнесен к соседнему гену ANKK1 (ankyrin repeat and kinase domain containing 1, 11q23.2), в котором он является миссенс-вариантом (c.2137G>A, p.Glu713Lys) [29]. Вариант rs1800497 хорошо исследован в отношении фармакогенетики некоторых лекарственных веществ и в связи с психическими нарушениями (шизофрения, склонность к суицидам), алкогольной зависимостью [30][31]. В российских исследованиях найдена ассоциации варианта rs1800497 гена DRD2 с выраженностью проявлений расстройств пищевого поведения у пациентов с избыточной массой тела, а также у девушек в возрасте 16–23 лет с массой тела, ИМТ, обхватом талии, величиной жировых складок на животе, плече и бедре [32][33]. Ассоциация варианта rs1800497 гена DRD2 с нарушениями пищевого поведения получена и в зарубежных исследованиях, в одном из них не было найдено ассоциации варианта с ожирением [34][35]. В США найдена ассоциация варианта с окружностью талии у молодых людей [36]. В Иране показана ассоциация rs1800497 гена DRD2 с расстройством пищевого поведения и ИМТ [37]. В крупном британском исследовании ассоциация варианта с ожирением не была подтверждена [38].

Согласно результатам проведенного исследования, однонуклеотидные варианты rs7903146 гена TCF7L2, rs1799883 гена FABP2, rs1800497 гена DRD2 не ассоциированы с морбидным ожирением у женщин из популяции г. Новосибирска.

Ген FTO (FTO alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase, 16q12.2) кодирует ядерный белок, функция которого пока не известна. Исследования показывают ассоциацию вариантов гена с ИМТ, риском ожирения и СД2 [39]. Однонуклеотидный вариант rs9939609 (g.87653T>A) локализован в интроне гена FTO и изучен на ассоциацию с ожирением во многих российских и зарубежных исследованиях на разных возрастных, половых и этнических группах. В Новосибирске у мужчин 25–35 лет генотип АА варианта идентифицирован как генотип риска ожирения (ИМТ 25–30 кг/м²) [19]. У жителей Московской и Свердловской областей, мужчин — жителей Кузбасса также найдена ассоциация варианта rs9939609 гена FTO с ожирением (ИМТ более 30 кг/м²): генотип АА и АТ варианта являются генотипами риска [24][25]. У женщин татарской этнической принадлежности найдена ассоциация варианта rs9939609 гена FTO с ожирением (ИМТ более 30 кг/м²) [40]. У детей возраста 7–17 лет из республики Татарстан показана ассоциация варианта с избытком массы тела II степени [41]. С ожирением у детей 7–18 лет в г. Иркутск и Ангарск ассоциирован генотип АА rs9939609 гена FTO [42]. Этот же генотип варианта ассоциирован с более высоким ИМТ, а в группе мужчин — с окружностью талии и бедер и массой тела в российском исследовании жителей Курска, Калининграда, Санкт-Петербурга [43]. Та же ассоциация генотипа АА с ИМТ найдена в исследовании в Якутии [44]. По данным крупного исследования на базе проекта ЭССЕ-РФ в Санкт-Петербурге, показано, что у метаболически здоровых людей с ожирением чаще встречается генотип ТТ rs9939609 гена FTO, что не совпадает с данными описанными выше, где генотип АА или аллель А являются генотипом или аллелем риска ожирения [45]. В исследовании в Ростове-на-Дону также генотипом риска ожирения стал генотип ТТ (для детей 3–17 лет) [46]. В зарубежных исследованиях показано, что аллель А варианта rs9939609 гена FTO является фактором риска увеличения жировой массы [47]. Вариант rs9939609 гена FTO ассоциирован с морбидным ожирением, по данным исследования GWAS в Китае, с морбидным ожирением у женщин, по данным исследования случай-контроль в США [48–51].

Согласно данным проведенного исследования у женщин генотип АТ и аллель А rs9939609 гена FTO являются генотипом и аллелем риска морбидного ожирения, генотип ТТ rs9939609 гена FTO ассоциирован с протективным эффектом в его отношении. Полученные результаты не противоречат данным мировых исследований.

Ген MC4R (melanocortin 4 receptor, 18q21.32) кодирует рецептор, взаимодействующий с адренокортикотропным и меланоцитстимулирующим гормоном. Ген не содержит интронов, мутации гена вызывают развитие аутосомно-доминантного ожирения [49]. Генотип СС rs17782313 (g.60183864T>C) гена MC4R является генотипом риска СД2, по данным исследования в Башкортостане, но не в Новосибирске, где не найдено ассоциации варианта с СД2 [52][53]. У женщин татарской этнической принадлежности найдена ассоциация варианта rs17782313 гена MC4R с ожирением (ИМТ более 30 кг/м²), у бурят подросткового возраста — с массой тела [40][54]. Согласно данным зарубежного метаанализа за 2020 г., rs17782313 гена MC4R ассоциирован с ожирением [55]. В Индии показана ассоциация варианта (аллель С) с ожирением с ИМТ более 30 кг/м² [56]. В Бразилии и Латвии не найдена ассоциация варианта rs17782313 гена MC4R с тяжелым ожирением, в Саудовской Аравии показана ассоциация с умеренным ожирением [57–59].

По результатам проведенного исследования, генотип ТС и аллель С варианта rs17782313 гена MC4R являются генотипом и аллелем риска морбидного ожирения у женщин. Генотип ТТ rs17782313 гена MC4R ассоциирован с протективным эффектом в отношении морбидного ожирения у женщин из популяции г. Новосибирска.

Проведенный регрессионный анализ позволяет сделать вывод о том, что, несмотря на присутствие в группе морбидного ожирения и контрольной группе лиц с нарушениями углеводного обмена (с которыми ассоциированы исследуемые варианты rs9939609 гена FTO и rs17782313 гена MC4R по данным литературы), ассоциация вариантов получена именно с морбидным ожирением, и нарушения углеводного обмена не влияют на значимость полученных результатов.

Ограничения исследования

Протоколом исследования не было предусмотрено ведение участниками пищевых дневников, а также определение их пищевого поведения. Исследование проведено только в группе женщин 45–69 лет, что требует проведения дополнительных исследований в группе мужчин и лиц молодого, подросткового и детского возраста для оценки значимости выявленных молекулярно-генетических маркеров морбидного ожирения rs9939609 гена FTO и rs17782313 гена MC4R в развитии данной нозологии в общей популяции. Результаты исследования могут быть полезны при разработке полигенного рискометра морбидного ожирения для женщин из европеоидной сибирской популяции. Несомненное преимущество такого подхода заключается в неизменности молекулярно-генетических маркёров в течение жизни индивидуума. То есть оценка риска может быть дана уже при рождении. Вероятно, поэтому в мире проводится много исследований, нацеленных на создание таких полигенных рискометров для распространенных заболеваний.

Заключение

Не обнаружено ассоциации с морбидным ожирением у женщин из популяции г. Новосибирска однонуклеотидных вариантов rs7903146 гена TCF7L2, rs1799883 гена FABP2, rs1800497 гена DRD2. Однонуклеотидные варианты rs9939609 гена FTO и rs17782313 гена MC4R ассоциированы с морбидным ожирением у женщин из популяции г. Новосибирска: гомозиготный генотип ТТ вариантов является условно протективным, а гетерозиготные генотипы — генотипами риска морбидного ожирения.

Дополнительная информация

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках ГЗ № FWNR-2024-0004, FWNR-2023-0004.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Иванова А.А. — статистический анализ, написание статьи; Шабанова Е.С. — интерпретация результатов, написание статьи; Зорина В.В. — молекулярно-генетический анализ, написание статьи; Гуражева А.А. — молекулярно-генетический анализ (проверка корректности работы тест-систем ПЦР с ПДРФ), написание статьи; Максимова С.В. — участие в разработке тест-систем для ПЦР с ПДРФ, генотипирование; Малютина С.К. — формирование групп для исследования; Максимов В.Н. — разработка тест-систем для ПЦР с ПДРФ, дизайн исследования, написание статьи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.