На протяжении многих десятилетий сахарный диабет (СД) остается независимым фактором риска развития и прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Среди причин смерти и инвалидизации пациентов с СД 2 типа (СД2) ССЗ занимают лидирующую позицию. Известно, что у пациентов с СД наблюдается ускоренное развитие и агрессивное течение заболеваний, ассоциированных с атеросклерозом. Наличие у пациентов традиционных факторов риска (курение, артериальная гипертензия, атерогенная дислипидемия, возраст) полностью не объясняет высокую частоту ССЗ, что заставляет изучать и другие возможные патогенетические механизмы [1].

Установлено, что при СД возрастает интенсивность кальцификации артерий. Так, микрокальцификация атеросклеротической бляшки способствует ее разрыву и развитию атеротромботических осложнений, тогда как медиальная кальцификация повышает жесткость артерий, нарушая регулирование гемодинамики [2, 3]. Механизмы и молекулярные пути развития сосудистой кальцификации (СК) при СД не установлены. Однако в настоящее время активно изучается клеточноопосредованный путь развития СК. Так, Eghbali-Fatourechi G.Z. и соавт. описали циркулирующие клетки-предшественницы остеобластов в периферической крови и впервые предположили, что данные клетки могут участвовать в эктопической кальцификации [4]. В дальнейшем эта гипотеза подтвердилась открытием миелоидных кальцифицирующих клеток и их участием в СК и кальцификации клапанов сердца [5–7]. В экспериментальных работах с клеточной культурой было показано, что циркулирующие клетки предшественницы (CD34+) у пациентов с высоким окрашиванием остеокальцина (OCN) способны образовывать минеральные отложения [8].

Вместе с тем известно, что циркулирующие эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК), выделяемые костным мозгом, являются высокоактивными клетками, способствующими поддержанию целостности эндотелия, его функций и предотвращающих гиперплазию интимы [9]. Однако в ряде исследований показано, что в популяции циркулирующих ЭПК имеются клетки, экспрессирующие ОCN и щелочную фосфатазу, принимающие активное участие в кальцификации интимы. Их количество увеличивается пропорционально прогрессированию атеросклероза. У больных СД2 и ишемической болезнью сердца (ИБС) была обнаружена повышенная экспрессия OCN и костной фракции щелочной фосфатазы на CD34+-клетках, при этом наблюдалось снижение экспрессии эндотелиальных маркеров, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста-2 (VEGFR-2) [8–11]. Теоретически, фенотипический сдвиг циркулирующих прогениторных клеток в направлении остеогенного фенотипа клеток может способствовать кальцификации сосудов у больных СД и тем самым – развитию и прогрессированию атеросклеротической кальцификации в ущерб процессам восстановления эндотелия. Данное явление может объяснять высокую частоту ССЗ и сердечно-сосудистых событий у больных СД2 [12].

Таким образом, накоплено достаточное количество данных о снижении количества ЭПК, нарушении их функций при СД2. В то же время неясна роль остеогенных циркулирующих прогениторных клеток (CD34+OCN+) в развитии и прогрессировании ССЗ у больных СД2. В литературе встречается несколько определений прогениторных клеток, экспрессирующих OCN: а именно ЭПК с остеогенной активностью, остеогенные прогениторные клетки, остеокальцин-экспрессирующие прогениторные клетки, прокальцифицирующий фенотип циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток.

Изучить содержание циркулирующих эндотелиальных (CD34+VEGFR2+) и остеогенных (CD34+OCN+) прогениторных клеток у больных ССЗ с сопутствующим СД2.

Дизайн исследования

Было проведено наблюдательное когортное одномоментное одноцентровое исследование.

Критерии соответствия

Критерии включения: возраст 45–80 лет, пациенты с ИБС или критической ишемией нижней конечности.

Критерии исключения: СД не 2 типа; острый коронарный синдром или острое нарушение мозгового кровообращения в течение предыдущих 6 месяцев; эндоваскулярные вмешательства в течение предыдущих 6 месяцев; гемоглобин менее 90 г/л; злокачественные новообразования, гемобластозы; тиреотоксикоз; терминальная стадия почечной или печеночной недостаточности.

Условия проведения

Набор пациентов проводился в ФГБУ «Национальный медицинский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва. В исследование включались пациенты, поступившие в отделение кардиологии, эндоваскулярной и сосудистой хирургии. Обследование пациентов проводилось в условиях стационара.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось с 2016 по 2018 гг.

Описание медицинского вмешательства

Всем пациентам было проведено стандартное клинико-лабораторное и инструментальное обследование. При сборе анамнеза обращали внимание на такие параметры, как длительность заболевания, отягощенная наследственность по сердечно-сосудистым заболеваниям, курение, физическая активность. Было проведено рутинное лабораторное обследование, которое включало определение липидного профиля (ХС, ЛПНП, ЛПВП, ТГ), уровня глюкозы в плазме крови, гликированного гемоглобина (HbA1c), креатинина; расчет скорости клубочковой фильтрации.

У пациентов без СД2 скрининг на выявление нарушения углеводного обмена проводился по уровню HbA1c и глюкозы плазмы натощак. Состояние углеводного обмена в группе больных СД2 оценивалось по уровню HbA1c; пациенты были обследованы на наличие микрососудистых заболеваний согласно существующим рекомендациям [13].

Пациентам по показаниям проводилась коронароангиография. Для количественного определения кальция в атеросклеротических бляшках коронарных артерий проводилась компьютерная томография коронарного кальция.

Для определения содержания CD34+OCN+ и CD34+VEGFR2+ прогениторных клеток пациентам проводился забор периферической венозной крови натощак.

Основной исход исследования

Основным исходом исследования явилось оценка содержания циркулирующих прогениторных клеток (CD34+OCN+- и CD34+VEGFR2+-клетки) в сравниваемых группах.

Дополнительные исходы исследования

Установлена связь между содержанием остеогенных прогениторных клеток с факторами, влияющими на прогрессирование ССЗ (атерогенной фракцией липидного спектра, тяжелым поражением коронарных артерий, кальцинозом коронарных артерий).

Анализ в подгруппах

Пациенты были разделены на две группы, в первую группу были включены пациенты с ССЗ (ИБС и/или угрожающей ишемией нижней конечности) и СД2, во вторую – с ССЗ без нарушения углеводного обмена, сформировавших группу контроля.

Методы регистрации исходов

Забор периферической венозной крови для определения содержания прогениторных клеток проводился в пробирки 4 мл Vacutainer (K3EDTA); χ окрашивание клеток проводилось не позже чем через 2 ч после забора крови в двух аликвотах. Использовались панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями. 1 пробирка: CD34 fitc, igG 1 изотипический контроль PerCP, igG 1 изотипический контроль PE; 2 пробирка: CD 34 fitc, anti- hVEGFR2/KDRPerCP, anti-OsteocalcinPE. Окрашивание антителами полученных образцов крови проводили согласно протоколу, рекомендованному производителем. Лизис эритроцитов проводили в растворе LysingSolutionIOTest 3 (Beckmancoulter, Франция) в течение 10 минут при комнатной температуре. Суспензию клеток отмывали в фосфатно-солевом буфере. Цитофлюориметрический анализ проводили на приборе FACSСalibur (BectonDickinson, США) с использованием программного обеспечения CellQuest. Анализировали 300–500 тысяч событий (клеток) для каждого образца. Количество клеток определяли в процентах от количества CD34+ клеток.

Расчет скорости клубочковой фильтрации проводился по формуле CKD-EPI (Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration).

Для оценки тяжести поражения коронарного атеросклероза использовалась шкала SYNTAX Score [14]. Индекс коронарного кальция оценивался по шкале Equivalent Agatston Score [15].

Этическая экспертиза

Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования одобрен на заседании Этического комитета ФГБУ «Эндокринологический научный центр» от 23 октября 2013 г. (протокол №11).

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: предварительного расчета выборки не проводилось.

Методы статистического анализа данных: для статистической обработки материала использовалась программа SPSS Statistics 22 (SPSSInc, США). Данные представлены в виде медианы [25-й; 75-й процентили]. Для описания качественных данных рассчитывали абсолютные (n) и относительные значения (%). Нормальность распределения проверялась критерием Шапиро-Уилка. Связь между количественными показателями устанавливали, используя непараметрический метод Манна-Уитни. Для анализа связей между категориальными переменными использовали критерий χ-квадрат Пирсона и точный критерий Фишера. Анализ корреляции переменных производился по методу Спирмена. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Объекты (участники) исследования

В исследование был включен 71 пациент (38 женщин, средний возраст 67 лет [62;74]). Были сформированы две группы, в 1-ю группу были включены 46 больных (28 женщин), во вторую – 25 (10 женщин).

Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту, полу, индексу массы тела (ИМТ), статусу курения, показателям липидного обмена, функции почек, ССЗ, проведению реваскуляризации миокарда и нижних конечностей (табл. 1).

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Примечания: *указана медиана (Me [Q25; Q75]). Тест Манна-Уитни для количественных величин, Хи-квадрат для номинальных величин.

Средняя длительность СД2 оставила 13 [8;21] лет. У 8 пациентов (17,4%) была диагностирована непролиферативная диабетическая ретинопатия (ДР), у 3 (6,5%) – препролиферативная ДР, у 3 (6,5%) – пролиферативная ДР, из них 1 пациенту была проведена лазерная фотокоагуляция сетчатки. Хроническая болезнь почек (ХБП) С2 была выявлена у 11 пациентов (23,9%), С3а – у 4 (8,7%) и С3б – у 2 (4,3%).

Пятидесяти пациентам (70,7%) была проведена коронароангиография по стандартной методике. Остальным пациентам для верификации стресс-индуцированной ишемии миокарда был проведен тредмил-тест (в 1-й группе – 3 (6,6%) пациентам, во 2-й – 12 (48,0%)) или стресс-эхокардиография – 3 (6,6%) пациентам в 1-й группе.

Пациенты обеих групп были сопоставимы по лекарственной терапии на момент включения в исследование (табл. 2). Большинство пациентов получали антиагрегантную и гиполипидемическую терапию. В группе пациентов с СД2 пероральную сахароснижающую терапию (ПССП) получали 26 пациентов (56,5%), интенсифицированную схему инсулинотерапии – 10 пациентов (21,7%). На комбинированной терапии инсулином и ПССП находились 10 пациентов (21,7%). При поступлении всем пациентам была проведена коррекция гиполипидемической и сахароснижающей терапии.

Таблица 2. Проводимая медикаментозная терапия при поступлении

Основные результаты исследования

У пациентов с ИБС или с ишемией, угрожающей нижней конечности, страдающих СД2, содержание циркулирующих CD34+OCN+-клеток было выше, чем CD34+VEGFR-2+-клеток (29,7 [26,2;36,1] и 11,8 [9,57;17,2] соответственно, p<0,001) (рис. 1).

Рис. 1. Циркулирующие прогениторные клетки в исследуемых группах.

Было установлено статистически значимое различие в количестве остеогенных прогениторных клеток в изучаемых группах. Так, в 1-й группе содержание CD34+OCN+-клеток было достоверно выше, чем во 2-й группе (29,7 [26,2;36,1] и 25,6 [17,3;30,7] соответственно, p=0,035) (см. рис. 1).

Кроме того, в группе больных СД2 выявлена статистически значимая положительная корреляционная связь CD34+OCN+-клеток с коронарным кальцием (r=0,53; p=0,004). Во 2-й группе подобной взаимосвязи не наблюдалось.

Выявлена положительная корреляционная связь количества CD34+OCN+-клеток с уровнем липопротеинов низкой плотности (r=0,4; р=0,032) и общего холестерина (r=0,27; р=0,05) (рис. 2) у больных СД2. У пациентов 2-й группы подобной корреляционной связи выявлено не было.

Рис. 2. Корреляция холестерина липопротеинов низкой плотности и содержания CD34+OCN+-клеток у больных СД2.

Пациенты в группе с СД2 характеризовались более тяжелым поражением коронарных артерий по шкале SYNTAX Score и высоким индексом коронарного кальция (табл. 3).

Таблица 3. Клиническая характеристика пациентов

В 1-й группе пациентов была выявлена положительная корреляция содержания остеогенных прогениторных клеток и индекса SYNTAX Score (r=0,50, p=0,021). У пациентов с ССЗ и СД2 была выявлена положительная корреляция CD34+OCN+-клеток с индексом коронарного кальция (r-=-0,49, p=0,034).

Нежелательные явления

В процессе исследования нежелательные явления зарегистрированы не были.

Резюме основного результата исследования

Представленное исследование показало повышенное содержание циркулирующих прогениторных клеток с остеогенной активностью у больных СД2, выявлена связь количества данных клеток с атерогенной фракцией липидного спектра, тяжелым коронарным атеросклерозом, кальцинозом коронарных артерий.

Обсуждение основного результата исследования

Известно, что наличие кальцификации коронарных артерий связано с высоким сердечно-сосудистым риском и является предиктором развития кардиоваскулярных событий [16]. В исследовании было показано, что у больных с ССЗ и СД2 содержание циркулирующих ЭПК (CD34+VEGFR2+-клетки), активно участвующих в восстановлении и поддержании стабильности эндотелия, а также предотвращающих развитие атеросклероза, было снижено, в то время как количество прогениторных клеток c остеогенной активностью (CD34+OCN+-клетки), ассоциированных с развитием и прогрессированием атеросклеротической кальцификации, – повышено. В ранее проведенном исследовании у пациентов с СД2 и ИБС также было выявлено повышение количества CD34+-клеток, экспрессирующих OCN и щелочную фосфатазу [17]. Вероятно, нарушение дифференцировки циркулирующих прогениторных клеток является одним из механизмов прогрессирования сосудистых осложнений, развивающихся при СД2. При этом процессы повреждения сосудистой стенки преобладают над процессами восстановления эндотелия.

Существует гипотеза, что процессы атерогенеза и эктопической кальцификации имеют общую патогенетическую основу, ассоциированную с воспалением. Кальцификация сосудистой стенки наблюдается на ранних стадиях формирования атеросклеротической бляшки [18]. До сих пор ведутся дискуссии, является ли сосудистая кальцификация причиной или следствием атеросклероза. Неоспорим тот факт, что степень кальцификации коронарных артерий является маркером тяжести атеросклероза. Ключевым моментом в инициации сосудистой кальцификации является фенотипическая трансформация резидентных клеток в клетки с остеогенным потенциалом, в число которых входят перициты сосудистой стенки, мезенхимальные стволовые клетки и циркулирующие прогениторные клетки [19]. Развивающиеся при СД2 воспаление, инсулинорезистентность, окислительный стресс могут влиять на реализацию остеогенного потенциала данных клеток. Провоспалительные, атерогенные факторы, продукты оксидативного стресса способствуют остеогенной трансформации клеток-мишеней, способных продуцировать гидроксиапатит, который включается в эктопические преципитаты. Кальцификация интимы формируется либо локально в виде точечной (пятнистой) кальцификации, либо диффузно в виде «листовой» кальцификации. Считается, что атеросклеротические бляшки с «пятнистой» кальцификацией более подвержены разрыву и развитию атеротромботических осложнений. В то время как «листовая» или диффузная кальцификация ассоциируется с бляшками, менее склонными к разрыву [20-22]. В данном исследовании мы выявили положительную корреляцию уровней общего холестерина и атерогенной фракции липидного спектра с содержанием остеогенных прогениторных клеток. Обнаруженный факт может указывать на активное участие данных клеток в процессах атеросклеротической кальцификации в данной когорте больных и еще раз показывает тесную взаимосвязь процессов атеросклероза и сосудистой кальцификации. Наши данные позволили также выявить связь количества остеогенных прогениторных клеток с тяжестью коронарного атеросклероза и васкулярной кальцификацией. Показана положительная корреляция количества CD34+OCN+-клеток с тяжелым поражением и кальцинозом коронарных артерий. Аналогичные результаты были получены в ранее опубликованном исследовании [8], где было показано, что у пациентов с атеросклерозом коронарных артерий был выявлен высокий процент содержания в крови остеогенных ЭПК.

Ограничения исследования

Малый объем исследуемой выборки не позволяет экстраполировать результаты на всю популяцию больных ССЗ и СД2. Одномоментный дизайн не позволяет достоверно судить о причинно-следственных взаимосвязях между признаками.

Полученные данные показали, что у больных СД2 содержание остеогенных прогениторных клеток повышено, при том, что количество ЭПК, препятствующих развитию атеросклероза, достоверно снижено. Эти данные позволили предположить, что активация остеогенных прогениторных клеток играет важную роль в повреждении сосудистой стенки, развитии сосудистых осложнений при СД2, может способствовать атеросклеротической кальцификации и, возможно, влияет на увеличение частоты развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных СД2.

Наши данные выявили, что процессы атеросклероза и кальцификации интимы являются взаимно отягощающими факторами, приводящими к прогрессированию ССЗ, особенно у пациентов с СД2. Наличие выраженного кальциноза сосудов при СД2 является неспецифическим маркером тяжелого поражения коронарных артерий. Полученные результаты подтверждают теорию клеточноопосредованного пути развития СК. У больных СД2 выявлена тесная корреляционная связь содержания CD34+OCN+-клеток с повышенной сосудистой кальцификацией, тяжелым многососудистым поражением коронарных артерий, что в совокупности может влиять на прогрессирование ССЗ в данной когорте пациентов.

Финансирование работы. Финансирование исследования проводилось в рамках государственного задания Министерства здравоохранения РФ по теме НИР: «Выявление иммуногистохимических и патоморфологических механизмов поражения сосудистой стенки и кальцификации артерий, а также механизмов развития микрососудистой ишемии у больных сахарным диабетом».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие двойственности (конфликта) интересов, связанных с данной рукописью.

Участие авторов. Дедов И.И., Шестакова М.В., Калашников В.Ю., Смирнова О.М. – концепция и дизайн исследования, редактирование и окончательное утверждение статьи; Степанова С.М. – выполнение лабораторных исследований, проверка и правка текста рукописи; Захаров А.С. – проведение рентгенэндоваскулярных вмешательств; Мичурова М.С. – сбор клинического материала, статистическая обработка результатов исследования, интерпретация результатов, написание текста рукописи.